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    公开号:WO1984003301A1
    申请号:PCT/JP1984/000047
    申请日:1984-02-16
    公开日:1984-08-30
    发明作者:Tetsuo Oka；Ryoichi Katsumata；Akio Ozaki；Toru Mizukami；Haruhiko Yokoi；Masako Hara
    申请人:Kyowa Hakko Kogyo Kk；
    IPC主号:C12P13-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 ア ミ ノ 酸 の 製 造 法
    [0002] 技 術 分 野
    [0003] 本発明は遺伝子の新規形質発現方法により了ミ ノ酸を製造 る方法 に関する。 さらに詳細には本発明はァミ ノ酸の生合成に闋与する遺伝 子を会む D N A断片とベクター D N Aとの組換え体 D N Aを用いコ リ ネバクテ リ ゥ厶属またはブレビバクテ リ ゥム属に属する微生物から選 ばれる琮主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、 培養^ ：アミ ノ酸を生成蓄積せしめ、 該培養物からアミ ノ酸を採取 するこ ご特徵とするァミ ノ酸の製造法に関する。
    [0004] 背 景 技 術
    [0005] 発酵法によるァミ ノ酸の直接製造法としては、 コ リネバクテ リ ウム 属， ブレビバクテリ ウム属， セ ラチア属などの細菌の野生株、 栄養要 求生株またはァミ ノ酸アナ口グ耐性株などの突然変異株を用いる方法 が知られている。
    [0006] たとえ ·'、 ヒスチジンアナログ耐性株を用いるヒスチジンの生産
    [0007] (特公 -8596) , ト リブトフ ァ ンアナログ耐性株を用いる ト リブト ファ ンの生産（ 特公昭 47-4505，特公昭 51 - 19037) , イ ソロイ シンアナ ログ耐性株を用いるィ ソロイ シンの生産（ 特公昭 47-38995, 特公昭 51 -6237,特公昭 54-32070)， フ エ二ルァラ ニンアナ口グ耐性株を用いるフ ェニルァラニンの生産（ 特公昭 56-10035)， フ 二ルァラ二ン要求生， チロシン耐性株などを用いるチロシンの生産 〔日本農芸化学会誌^ (1)
    [0008] R79〜R87 (1976) 〕 ， L —アルギニンアナログ耐性株などを用いるァ ルギニンの生産 〔Agr. B i ol. Chem.， 36, 1675〜1684 (1972) ， 特公 昭 54-37235， 特公昭 57 - 150381 〕 などが知られている。
    [0009] 発 明 の 開 示
    [0010] 本発明者らはコ リネバクテ リ ゥ厶属あるいはブレビバクテリ ウ厶属
    [0011] O PI の細菌を用いるァミノ酸生産法において、 従来のァミノ酸生産性変異 の付与による育種とは全く異なる組換え D N A技法によるアミノ酸の 生産方法についで研究を行った。
    [0012] 本発明者らは先にコ リネバクテリゥム属またはブレビバクテリゥム 属に属する微生物中で自律複製し、 選択可能な表現型と適当なクロー ニング部位を有するプラスミ ドベクターを造成する一方、 効率の高い 形質転換系を開発し特許出願を行った （特開昭 57-183799， 同 5 7 - 186492, 同 57-186489)。 また本発明者らは該プラスミ ドベクターに既 に知られているィ ンビ ト口における組換え体 D N A技法 （Methods i n Bnzymo l ogy, り 8, Recomfa inart DNA, ed i ted b Ray Wu, Academ i c Press 1979 , USP 4, 237， 224)を用い、 グルタ ミ ン酸、 リジンなどのァ ミノ酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含む D N A断片を連結し、 開発した形質転換系を用いてコ リネバタテリゥム · グルタ ミクム L - 2 2·株またはその誘導株を形質転換したところ、 該外来性遺伝子が該 宿主中で形質を発現され、 該ァミノ酸の生産増大に利用することがで きることを見出し特許出願を行つた （特開昭 58- 126789)。
    [0013] さらに研究の結果、 ヒスチジン， ト リプトフ ァ ン， フ ヱニルァラ二 ン、 イ ソロイ シン， チロ シンおよびアルギニンに闋しても同様の方法 によって得られた菌株が著量にこれらァミノ酸を培地に蓄積できるこ とを見出し本発明を完成するに至った。
    [0014] コ リネバクテリゥ厶属またはブレビバクテリゥ厶属に属する微生物 を宿主として用い、 これに該宿主に対して外来性であるところの目的 遺伝子またはべクタ一を舍む組換え体 D N Aを導入しで該目的遺伝子 の形質を発現させァミノ酸の生産性を向上させた例は今まで全く知ら れていない。
    [0015] 以下本発明を詳細に説明する。
    [0016] 本発明はァミノ酸生成に闋与する遺伝子を含む D N A断片とベクタ — D N Aとの組換え体 D N Aを用いるコ リネバタテリゥム属またはブ
    [0017] O PI レビバクテ リ ゥ厶属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換 して得られる形質転換株を培地に培養し、 ァミ ノ酸を製造する方法を 提烘する。
    [0018] 本発明に係るアミ ノ酸としてはヒスチジン， ト リプト ファ ン， フエ 二ルァラニン， イ ソロイ シン， チロ シンおよびアルギニンがあげられ な o
    [0019] 本発明に用いる遺伝子を含む D N A断片としては、 真核生物， 原核 生物， ウィルス ， ノ クテ リオファージまたはプラス ミ ドに由来し本発 明ァミ ノ酸の生成に闋与する遺伝子を含む D N A断片があげられる。 原核生物に由来する遺伝子としては細菌とく にエッ シェ リ ヒァ属， コ リネバクテ リ ウ厶属， ブレビバクテ リ ウム属、 ミ クロバクテ リ ウム属， バチルス属， スタフイ ロコ ッカス属， ス ト レプトコ ッカス属， .または セラチア属に属する細菌の菌株に由来する遺伝子で、 本発明のァミ ノ 酸の生合成ならびにその生合成に関与する代謝系に係る遺伝子が好適' にあげられる。 とく に ^適な遺伝子源としては、 上記細菌から誘導し たアミ ノ酸生産性株， アミ ノ酸アナログ耐性株などが用いられる。 該 アミ ノ酸アナ口グ耐性は、 クローン化後プラス ミ ド上にて付与するこ ともできる。
    [0020] ヒスチジン生合成に闋与する遺伝子の供給源の例としては、 コ リネ バタテ リ ゥム ♦ グルタ ミ クム C 1 5 6株およびエツ シヱ リ ヒア · コ リ K12株 ATCC23740 の染色体 D N Aがあげられる。 （： 1 5 6株は1， 2 4 - ト リ ァゾール - 3 -ァラニン耐性でヒスチジン生産能を有し、 ェ 業技術院微生物工業技術研究所に F E RM P-6910 (寄託日昭和 5 8年 2月 8 曰） 〔これは昭和 5 9年 1月 1 9 日付で F ERM BP- 4 5 3に移管され た〕 寄託されている。
    [0021] ト リブト ファ ン生合成に関与する遺伝子の供給源の例としては、 ブ レビバクテ リ ゥ厶 · フラブム ATCC 14067 の染色体 D N A (アンスラニ ル酸合成酵素遺伝子） ， コ リネバタテ リ ゥム · グルタ ミ クム ATCC 13032
    [0022] O PI
    [0023] /IPO の染色体 D N A (アンスラニル酸合成薛素遺伝子） などがあげられる。 フエ二ルァラニンの生合成に闋与する代謝系に係る遺伝子としては、 コ リス ミ ン酸ミ ユタ一ゼおよびプレフヱン酸デヒ ドラターゼの遺伝子 があげられる。 さらにそのような遺伝子にフヱニルァラニン， チロ シ ンま はそれらのアナ口グに封する耐性、 たとえばパラフルォロフヱ 二ルァラニン （ P F P ) 耐性を付与したものも用いることができる。 そのような遺伝子の供給源としては、 コ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム K 3 8 ( P F P耐性） があげられる。
    [0024] イ ソ口イ シンの生合成に闋与する遺伝子の供給源の例としては、 ァ スパラギン酸からスレオニンに到るスレオニン生合成に係る酵素の遺 伝子を含む D N A断片があげられる。
    [0025] ァスパラギン酸からスレオニンに到るスレオニン生合成に係る酵素 としては、 ァスノヽ。ルトキナーゼ， ァスノヽ。ラギン酸セミ アルデヒ ドデヒ ドロゲナーゼ、 ホモセ リ ンデヒ ドロゲナーゼ、 ホモセリ ンキナーゼぉ よびスレオニンシンターゼがある。 〔Agr. Biol. Chem.， 38, 993 (1974)] 。
    [0026] スレオニン生合成に係る酵素の遺伝子の具体例に好適な一例として は、 大腸菌 K一 1 2のスレオニン · オペロ ンの D N Aを含む組換え体 プラス ミ ド p E t h r lがあげられる。
    [0027] 本癸明のチロシン生合成に係る遺伝子の供給源としては、 大腸菌 J A 1 9 4株 〔Proc. Natl. Acad. Sci. , 74, 487 〜491(1977) 〕 が具 体的な例として用いられる。
    [0028] なお、 微生物における芳番族ァミ ノ酸の生合成経路ならびにその調 節様式については、 大腸菌， 枯草菌， コ リネバクテ リ ゥム属ゃブレビ バクテ リ ゥム属などのグルタ ミ ン酸生産菌などにおいて詳細に研究さ れている 〔農芸化学会誌 ^£(1)， R79 〜R87， （1976)および Ann. Rev.
    [0029] Biochemistry 47, 533 (1978) 参照〕 。 本発明におけるチロシン生合 成に係る遺伝子としては、 これら芳香族アミノ酸の生合成に直接、 間 OMPI
    [0030] - WIPO 接に関与する酵素のうち少なく とも 1つの酵素の遺伝情報を担う D N A断片を用いる.。 とく に生合成系上の調節部位とされる 3 -デォキシ 一 D— ァラ ビノ —ヘプッ ロ ソ ン酸 7 — ホスフ ェー ト （ 3-deoxy- D- arabino-heptulosonate-7-phosphate ； 以下 D A H Pという ) 合成酵 素 （以下 D A H P a s eという ） ， コ リ ス ミ ン酸ミ ユターゼ （以下 C M a s eという ） ， プレフ エネー ト ♦ デヒ ドロゲナーゼ （以下 P D G a s eという ） ， プレラ ロ シ ン * ァ ミ ノ ト ラ ンスフ ェ ラ ーゼなどの 酵素の遺伝情 を担う D N Aが好適である。 さらに、 これら遺伝子で フ ィ ードバック阻害が外されているもの （元来無い場合も含む） 、 レ プレショ ンが外されているものも用いることができる。
    [0031] L -アルギニン生合成に係わる酵素としては、 N -ァセチルダルタ ミ ン酸シンタ ーゼ， N— ァセチルグルタモキナーゼ， N— ァセチノレグ ルタ ミ ン酸- τ ー セ ミ アルデヒ ドデヒ ドロゲナーゼ， N -ァセチル^ レニチ ン 一 3— ァ ミ ノ ト ラ ンスフ ヱ ラ ーゼ， ァセチノレオノレ二.チ ンテ5 "ァ セチ ラ ーゼ， N— ァセチルグルタ ミ ン酸— ァセチルオル二チ ンァセチ ノレ ト ラ ンスフ ェ ラ ーゼ， オル二チ ンカノレノ モイ ソレ ト ラ ンス フ ヱ ラ ーゼ， アルギノ コハク酸シンセタ ーゼ， アルギニノ サク シナーゼがある 〔Agr. Biol. Chem. , 43, 1899〜1903 (1979) 〕 。
    [0032] 本発明におけるアルギニン生合成に係る酵素の遺伝子としては、 こ れら酵素のうち少なく とも一つの酵素の遺伝情報を担う D Ν Αがあげ られる。
    [0033] 本発明で用いるアルギニン生合成に係わる遺伝子を含む D Aの具 体的に好適な例として、 大腸菌 ― 1 2株の染色体地図上、 9 0分近 傍に収束して位置するァセチルオルニチンデァセチラーゼ （ a r g E ) Nー ァセチルグノレタ ミ ン酸— r —セ ミ アルデヒ ドデヒ ドロゲロナーゼ ( a r g C ) 、 N— ァセチルグルタモキナーぜ ( a r g B ) およびァ ルギニノサク シナーゼ （ a r g H ) を含む遺伝子群 〔Glansdorff， N. ： Genetics, 51, 167 ( 1965) 〕 があげられる。 実施例において
    [0034] OMPI
    [0035] WIPO は大腸菌 K - 1 2秣のこのアルギニン生合成遺伝子群の D Aを含む 組換え体プラスミ ド p E a r g 1を用いた。
    [0036] P E a r g 1は大腸菌の遺伝子組換え系を用いて p L C 2 0 - 1 0 と p C E 5 3の組換え体として取得できる。 p L C 2 0 — 1 0は大腸 菌 K - 1 2株のジーンバンク中から得られ、 上記アルギニン生合成遺 伝子群を有することが知られている 〔Clarke， et al. ： Cell, 9 , 91， (1976)] c
    [0037] 本発明に用いるぺクターとしては、 宿主菌細胞内で自律増殖できる ものでなくてはならない。 具体例としては本発明者らがコ リネバクテ リゥム属に属する微生物から採取した、 また採取したものから誘導し て造成した P C G 1 (特開昭 57- 134500)， p C G 2 (特開昭 58- 35197),
    [0038] P C G 4 (特開昭 57- 183799)， PCB51, PCB52 (特開昭 58-126789)，
    [0039] P C E 53 (特開昭 58-25398)， p C E 5 4 , p C G 1 1 , p C B 100
    [0040] (特開昭 58- ί05999)などが'あげられる。
    [0041] これらプラスミ ドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託番号で工業 技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ァメ リカ ン · タイプ ·カル チヤ一 ' コ レク ショ ンに寄託されている。
    [0042] プラス ミ ド F E R - Ρ A T C C
    [0043] P C G 1 5 8 6 5 3 1 8 0 8
    [0044] P C G 2 5 9 5 4 3 1 8 3 2
    [0045] P C G 4 5 9 3 9 3 1 8 3 0
    [0046] P C E 54 - 3 9 0 1 9
    [0047] P C G 11 - 3 9 0 2 2
    [0048] P C B 101 - 3 9 0 2 0
    [0049] P C B 5 1 , 5 2， 5 3， 5 4は上記プラス ドから以下の とく 誘導できる。
    [0050] たとえば、 p C E 5 1は次のように作成することが出来る。
    [0051] まず、 p C G lをその保有菌コ リネバクテリウム · ダルタ ミクム
    [0052] O PI 2 2 5 — 5 7株（ FERM- P 5 8 6 5 , A T C C 3 1 8 0 8 ) の培養菌 体から前記の特許出願明細書 （特開昭 5 7 - 1 3 4 5 0 0 ) に開示し た方法で、 p G A 2 2をその保有大腸菌の培養菌体から通常用いられ る方法 〔An， G. et al.， J. Bacteriol., 140 , 400, (1979)] で濃 縮単離する。 プラス ミ ド p C G 1を制限酵素 B g 1 Πで直鎖状化し、 これに P G A 2 2を制限酵素 B a m H Iで消化して得たカナマイ シン 耐性 （ K m R ) 遺伝子を舍む方の断片を、 両者の同一接着末端を利用 して連結する。 この D N A混成物からの p C E 5 1の選択は P G A 2 2に由来する K m R のみを有するコ リネバクテリ ゥム属あるいはブレ ビバクテ リ ゥム属菌種の形質転換株を分離し、 これら形質転換株の保 有するプラス ミ ドを解析することによって達成される。 p C E 5 1は 大きさ約 6 K bのプラス ミ ドで、 制限部位として H i n c H , H i n d m , S m a I , X h o I , E c o R Iなどを有し、 K mR の表現型を 与 る。
    [0053] P C E 5 2および P C E 5 3は次のようにして作成することができ る。 まず、 p C G 1をその保有菌コ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム 2 2 5 — 5 7株 （ F E R M - P 5 8 6 5 , A T C C 3 1 8 0 8 ) の培 養菌体から前記の特許出願明細書に開示した方法で、 p G A22をその 保有大腸菌の培養菌体から通常用いられる方法で濃縮単離する。 ブラ ス ミ ド p C G 1上に 1個所ある B g 1 Π切断部位と p G A 2 2上に 2 個所ある B a m H I切断部位の一方の切断部位のみを両制限酵素 B gl Π， B a m Η Iでそれぞれ消化して直鎖状化した後、 プラス ミ ド分子 の両端に単鎖として突き出た同一接着末端で両 D N A分子が連結した 和合分子を生成させるために T 4フ ァ -ジ D N A リガ -ゼを作用させ る。 この D N A混成物中からの両プラス ミ ド分子の和合連結した組換 え体プラス ミ ドの取得は、 一旦、 p G A 2 2に由来する薬剤耐性で選 択されるコ リネバクテ リ ゥ厶属あるいはブレビパクテ リ ウム属菌種の 形質転換株を分離し、 これら形質転換株の保有するプラス ミ ドを解析 することによって達成される。
    [0054] p C E 5 2および P C E 5 3は大きさ約 1 0.9 K bのプラス ミ ドで、 制限部位として E c o R I , S a l I ， S m a I , X h o lなどを 有し、 p C E 5 2はクロラムフエニコ —ル耐性 （ C m R ) ， K m R の 表現型を、 p C E 5 3はテ ト ラサイク ！； ン耐性 （ T c R ) ， C m R ， K mR の表現型を与える。 X h 0 I部位は K m R 遺伝子にあり、 いわ ゆる挿入不活化 （ D N A断片の挿入により当該表現型の凳現が妨げら れる現象） による選択も可能である。
    [0055] 上記 D A混合物による形質転換は、 本発明者らが先に特許出願し たコ リネバクテリ ゥム属およびブレビバクテ.リ ウム属菌種のプロ トプ ラス トを使用する形質転換 （特開昭 5 7 - 1 8 6 4 9 2および特開昭 5 7 - 1 8 6 4 8 9 ) により実施することができる。 選択に用いる薬 剤は用いるプラス ミ ド上にコ - ドされている薬剤耐性遺伝子のうち、 挿入不活化され.る耐性 ¾伝子を除いた他の耐性遺伝子に対する薬剤を 使用すればよい。 形質転換株は D A無添加系で受容菌プロ トプラス トが正常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤 〔通常、 T c O.4 - 1.6 Ai g /ml， C m 2.5 - 5 /i g /ml, K m l 0 0 - 8 0 0 ^ g /mU S m 100 - 4 0 0 ^ g" / mU S p e c 2 0 0 - 1, 000 M g / m を舍 む高張寒天培地上で形成されるコロニ -を分離するか、 あるいは、 一 旦穽選択的に再生培地上で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、 この懸濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤 （通常 c 0.5 - 4 ί g / ml , C m 2 - 1 5 u g / ml , K m 2 - 2 5 g /ml， S m 5 - 5 Q ju g / ml , S p e c 5 0 — 5 0 0 z g /nil) を含む寒天 培地上で生育するコロニ -を分離することによって得られる。 T c R ， C m R , K m R により選択された形質転換株の中には、 p G A 2 2由 来の他の薬剤耐性形質をも同時に獲得しているものがある。
    [0056] こう して得られる形質転換株の保有するプラス ミ ド D N Aは、 本発 明者らが特開昭 5 7 - 1 3 4 5 0 0および特開昭 5 7 - 1 8 6 4 8 9 に開示した方法で培養菌体から単離精製でき、 さちに各種制限酵素で 消化して生成する断片をァガロ -スゲル電気泳動で解析する常法によ り構造を知ることができる。 形質転換株から分離されたプラス ミ ドが p C E 5 1 , C E 5 2 , p C E 5 3である。
    [0057] プラス ミ ド保有菌株からのプラス ミ ドの採取は、 たとえば特開昭 57 — 1 3 4 5 -0 0 , 同 5 7 — 1 8 3 7 9 9および特開昭 58— 3 5 1 9 7 に記載の方法に従って行えばよい。 遺伝子を含む D N A断片とぺク タ - D N Aとの組換え体の作成は、 公知の試験管内組換え D N A技法 を駆使することにより実施できる。
    [0058] 試験管内 D N A組換えは、 通常、 目的の遺伝子を含む供与体 D N A の切断と結合 （ リガ-ゼ反応） により行われる （特開昭 5 8 - 126789, U S P 4, 237, 22 参照） 。
    [0059] リガ-ゼ反応により目的の組換え体以外に他の組換え体も生成する が、 目的の組換え体を取得する'には'この D N A混成液を用いてコ リネ バクテ リ ゥム属またはブレビバクテ リ ム属菌種を直接形質転換し、 目的の遺伝子の遺伝情報に由来する遺伝子形質を付与された形質転換 株を選択分離し、 その培養菌体から抽出単離することによって達成で きる。 コ リネバクテ リ ゥム属またはブレビバクテ リ ウム属菌種を直接 形質転換しないで例えば大腸菌のような他の微生物の宿主ぺク夕 -系 にて目的の遺伝子を一旦ク口 - ン化し、 しかる後にコ リネバクテリ ウ ム属またはブレビバクテ リ ゥム属菌種のベクタ -との組換え体を試験 管内で作製してからコ リネバクテ リ ゥム属またはブレビバクテ リ ウム 属菌種を形質転換し前記と同様に形質転換株を選択分離しても組換え 体を取得できる。
    [0060] 宿主大腸菌で遺伝子をクロ - ン化する方法は例えば Methods in Enzymology, 6 8巻， Ray u(Ed) Academic Press New York ( 1979年) に記載されている。
    [0061] また組換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用できる。 S. N. Cohen, et_ al, U. S. Patent 4, 237, 224, 遺伝子操作実験法 〔高木康敬編著， 講談社サイ ェンティ フィ ッ ク （ 1980) 〕 、 Methods in Bnzymology 68， Recombinant DNA ， edited by Ray Wu， Academic Press 1979，特開昭 5 8 — 1 2 6 7 8 9。
    [0062] 本発明の宿主微生物としては、 コ リネバクテリゥム属またはブレビ バクテリウム属に属し D N A取り込み能を有する菌株ならばいかなる 菌株を用いてもよい。 好適には次の菌株があげられる。
    [0063] 寄 託 審 号
    [0064] FERM-P ATCC コ リ不ノ クテ ゥム グルタ ミ クム 13032 コ リ ネ ノヾクテ ゥム グルタ ミ クム L - 1 5 5946 31834 π ひネ.ノヾクテ ゥム グルタ ミ クム L A - 105
    [0065] 3 リ ネ ノ クテ ゥム グルタ ミ クム K 3 8 7087
    [0066] コ リネパ 'クテ ゥ厶 グルタ ミ クム · K 4.3 7162
    [0067] コ リネパクテ ゥ厶 ノヽ 一キュ リス 13868 コ リネパ'クテ ゥム ハ ーキユリス L -103 5947 31866 コ リネパクテ ゥ厶 ァセ トァシ ドフイ ラ厶 13870 コ リ ネノヾクテ ゥ厶 リ リ ウム 15990 ブレビパ'クテ ゥ厶 ディバリ カツム 14020 ブレビバクテ ゥム ディ バ リ カ ツム L-204 5948 31867 ブレビパ'クテ ゥ厶 ラク ト フアーメ ンタム 13869 ブレビパクテ ゥム ラク ト フ アーノ ンタム L- 312 5949 31868 ブレビパ'クテ ゥム フ ラノ 厶 14067 ブレビノ クテ ゥム イマ リオフィ ラム 14068 ブレビノ クテ ゥム チォゲンタ リス 19240 宿主微生物の組換え体 D N Aによる形質転換は 1 ) 培養細胞からの プロ トプラス トの調製、 2 ) プロ トプラス トの組換え体 D N Aによる 形質転換処理、 3 ) プロ トプラス トの正常細胞への復帰再生と形質転
    [0068] ΟΜΡΙ 換株の選択、 からなる工程にて行われる。 具体的方法の例を以下に彔 す。
    [0069] 1 ) 培養細胞からのプロ トプラス トの調製
    [0070] プロ トプラス ト形成は、 微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感 受性にする条件下で増殖させ、 この培養細胞を高張液中でリゾチー ム作用させ細胞壁を溶解除去することによつて行われる。 微生物を リゾチーム感受性型細胞にするには各種細胞壁合成阻害剤が用いら れる。 例えば、 微生物培養の対数増殖期の中途で成育を抑制しない かあるいは半抑制する濃度のぺニシリ ンを添加し、 さらに数世代増 殖させることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にすることが できる。
    [0071] このと.き使用する培地は微生物が増殖できる培地であればよく、 例えば栄養培地 N B (粉末ブイ ヨ ン 2 0 g、 酵母エキス 5 gを純水 1 ·Τに含み、 ρ Η了.2に調整した培地， 以下同じ） あるいは半合成 培地 S S Μ 〔グルコース 1 0 g、 N H 4 C 4 g、 尿素 2 g、 酵母 エキス l g、 K H 2 P 04 l g、 K 2 Η Ρ 04 3 g、 U g C β 2 · 6 H 2 0 0. 4 g、 F e S 04 * 7 H 2 0 1 0 mg, M n S 04 - 4〜 6 Η·2 0 0. 2 mg、 Z n S 04 · 7 H 2 0 0. 9 mg、 C u S 04 • 5 H 2 0 0. 4 mg, N a 2 B 4 07 · 1 0 H 2 0 0. 0 9 mg、
    [0072] ( N H 4 ) 6 M o 7 024 ♦ 4 H 2 0 0. 0 4 mg、 ピオチン 3 0 〃 g、 サイ了ミ ン塩酸塩 1 mgを水 1 ίに含み、 ρ Η 7. 2に調整した培地、 以下同じ〕 などが用いられる。
    [0073] この培地に微生物を接種し、 振盪培養する。
    [0074] 比色計によって 6 6 0 n mにおける吸光度 （ 0 D ) を測定し対数 増殖期の初期 （ 0 D = 0. 1〜0. 4 ) に培養液中 0. 1〜2. 0単位/ ml の濃度になるようにぺニシリ ン Gなどのべ二シリ ン類を添加する。
    [0075] 培養をさらに続けて、 0 Dが 0. 3〜0. 5に増加したところで細胞を 集菌し S S M培地で洗浄する。
    [0076] . . 次いで細胞を適当な高張培地、 例えば P F M培地 （ S S M 2倍希 釈液中にショ糖 0.4 M、 M g C ^ 2 * 6 H 2 0 0.0 1 Mを含み、 p H 7.0〜8.5に調整した培地、 以下同じ） あるいは R C G培地 〔グルコース 5 g、 カゼィ ン加水分解物 5 g、 酵母エキス 2.5 g、 K a H P 04 3.5 g、 K Η2 Ρ 04 1.5 g、 Μ g C £ 2 · 6 Η 2 0 0.4 1 g、 F e S 04 · 7 Η 2 0 1 0 mg、 Μ η S 04 · 4〜6
    [0077] Η 2 0 2 mg、 Ζ η S 04 · 7 Η 2 0 0.9 rag、 C u S 04 · 5 Η20 0.4 mg、 Ν a 2 Β 4 07 · 1 0 Η 2 0 0.0 9 rag、 （ Ν Η 4 ) 6 Μ ο 7 024 * 4 Η 2 0 0.0 4 mg、 ピオチン 3 0 z g、 サイ ァミ ン 塩酸塩 2 mg、 コハク酸ニナ ト リ ウム 1 3 5 gを水 1 に含み、 p H 7.0〜8.5に調整した培地、 以下同じ〕 もしく は R C G培地にポリ ビニ.ルピロ リ ドン 3 %を添加した培地 （ R C G P培地、 以下同じ） に再懸篛する。 この細胞懸濁液に最終濃度 0.2〜 1 O mg/mlとなる ようにリゾチームを加え 3 0〜 3 7でで反応させる。 プロ トプラス ト化は反応時間が進むにつれて進行し、 その経過は光学顕微鏡で観 察できる。 顕微鏡下でほとんどの細胞がプロ トプラス ト化されるに 要する時間は、 細胞培養時の添加ぺニシリ ンの濃度および用いる ひ ゾチームの濃度によって変わるが、 前記条件にて 3〜 2 4時間であ 生成したプロ トプラス トは低張条件で破裂死するので、 プロ トプ ラス トの形成度は低張条件で生残する正常細胞の残存度で間接的に 知ることができる。 通常、 正常細胞はリゾチーム処理洪試正常細胞 の約 1 0— 4の残存度に抑えることができる
    [0078] このようにして調製したプロ トプラス トは適当な高張寒天培地で コローニ形成能 （再生能） を有する。 この寒天培地としては栄養培 地、 半合成培地あるいは数種類のァミ ノ酸を補充した合成培地に
    [0079] 0.3〜0.8 Mコハク酸ニナ ト リ ゥムおよび 0.5〜 6 %ポ リ ビニルビ 口 リ ドン （分子量 10， 000あるいは 40， 000 ) を含有せしめたものが好
    [0080] O PI 適に用いられる。 通常、 半合成 R C G P寒天培地 〔 R C G P培地に 1. 4 %の寒天を添加した培地、 P H 7. 2〕 を用いることができる。 培養は 2 5〜 3 5 t:で行うのが好ましい。 再生コロニーの出現が認 められるのに要する培養日数は菌株により差があるが、 釣菌できる までの大きさになるのは 1 0〜 1 4 日である。 R C G P培地でのプ ロ ト プラ ス トの再生は菌種、 培養中途ぺニシ リ ン添加濃度およびリ ゾチーム処理濃度によって異なるが、 リゾチーム処理供試正常細胞 あたり 1 0 — 2〜： 1 0 一4 の効率である。 '
    [0081] 2 ) プロ ト プラス トの組換え体 D Aによる形質転換
    [0082] プロ トプラス トへの組換え体 D N Aの取り込みは細胞がプロ トプ ラ ス ト状態を保持できる高張液中でプロ トプラス トと組換え体 D N Aとを混合し、 これに D N A取り込み媒介作用のあるポ リエチ レン グリ コール （ P E G、 平均分子量 1， 540 〜6， 000 ) あるいはポ リ ビ ニルアルコ ール （ p V'A、 重合度 500〜 1, 500)と二価金属陽ィォン - を加え処理することによって行われる。 高張 件を"^える安定化剤 としては、 微生物のプロ トプラス トの保持に一般に使われるもので よく、 例えばショ糖ゃコハク酸ニナ ト リ ウムを用いることができる。 P E Gおよび P V Aの使用可能な濃度範囲は最終濃度で各々 5〜60 %、 1〜 2 0 %である。 二価金属陽ィォンは最終濃度 1〜100 m の、 例えば C a ++， M g ++ , M n + + , B a ++， S r + +などが効果的 で単独あるいは併用することができる。 処理の温度は 0〜 2 5 が 好適である。
    [0083] ) プロ ト プラ ス トの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選択
    [0084] 組換え体 D Aで形質転換処理したプロ トプラ ス トの再生は、 前 記のプロ トプラス トの再生と同様に、 コハク酸ニナ ト リ ウ厶とポ リ ビニルピロ リ ドンを含有する高張寒天培地 （例えば R C G P培地） 上にプロ トプラ ス トを塗布し、 正常細胞が生育できる温度、 一般に 2 5〜 3 5でで培養することによって行われる。 形質転換株は供与
    [0085] WIPO D N Aに由来する遺怯子が菌に付与する形質について選択すること によって取得できる。 この特徵的形質獲得に基づく選択は、 高張寒 天培地上で再生と同時に行ってもよく、 あるいは一旦非選択的に再 生させてから再生正常細胞を集め普通の低張寒天培地上で行っても よい。
    [0086] 本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したリゾチーム 感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工程ひ)におけるぺニシ リ ン処理を行わずに単に培養増殖させた細胞を直接リゾチーム処理 する以外は上記工程 (1)〜(3)と同様に行えばよい。 リゾチーム感受性 微生物を用いる場合の形質転換株は再生菌あたり 1 0—2〜 1 0— 4の 高頻度で得られる。 ，
    [0087] 本発明で得られる形質転換株の具体例としては下記のものがあげ られる。
    [0088] ヒスチジン生産菌株
    [0089] コ リ ネバクテ リ ウム · ダルタ ミ クム K32， ATCC39281
    [0090] コ リ ネパクテ リ ゥム · ハーキユ リ ス K33， ATCC39282
    [0091] ブレビバクテ リ ゥム · フラバム K34， ATCC39283
    [0092] ブレビバクテ リ ウム . ラク ト ファーメ ンタム K35, ATCC39284 コ リ ネパクテ リ ゥム * グルタ ミ クム K49, FERM BP-464 ト リプト フ ァ ン生産菌株
    [0093] コ リ ネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム K20， ATCC39035
    [0094] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K31， ATCC39280
    [0095] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム Κ37, ATCC39285
    [0096] フ エ二ルァラ 二ン生産菌株
    [0097] コ リネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム K39， FERM P - 7088
    [0098] イ ソ口イ シン生産菌秣
    [0099] コ リ ネバク—テ リ ウム · グルタ ミ クム K41， FERM P-7161
    [0100] ブレビバクテ リ ウム · フラブム K42， FERM BP-355 一 OMPI チロ シン生産菌株
    [0101] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K44， FBRM P-7163
    [0102] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム 45, FBRM P-7164
    [0103] 了ルギニン生産菌株
    [0104] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K46， FBRM BP - 356
    [0105] コ リネバクテ リ ゥム · ハーキュ リス K47, FBRM BP— 367
    [0106] ブレビバクテ リ ウ厶 · フラブ厶 K48， FBRM BP-357
    [0107] 形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入した組換え 体 D N Aの形質を発現させることができる。 組換え体 D Aに遺伝子 D N Aまたはベクター D N A由来の性質が付与されている場合は、 そ の性質にあわせて培地に薬剤を補給するときもある。
    [0108] かく して得られた形質転換株を、 従来醱酵法によるァミ ノ酸製造に 用いられる培養方法により培養することによって、 ァミ ノ酸を製造す る とができる。 すなわち、 該形質転換株.を炭素源、 窒素源、 無機物、 アミ ノ酸、 ビタ ミ ンなどを含有する通常の培地中、 好気的条件下、 温 度、 p Hなどを調節しつつ培養を行えば、 培養物中にァミ ノ酸が生成 蓄積するので、 これを採取する。
    [0109] 炭素源としてはグルコース ， グリ セロール， フラク ト ース， シユー クロース ， マル ト ース ， マンノ ース ， 澱粉， 澱粉加水分解液， 糖蜜な どの種々の炭水化物， ポ リ アルコール， ピルビン酸， フマール酸， 乳 酸， 酢酸などの各種有機酸が使用できる。 更に菌の資化性によって、 炭化水素， アルコール類なども用いうる。 と く に廃糖蜜は好適に用い られる。
    [0110] 窒素源としてはァンモニァあるいは塩化ァンモウ厶 ， 硫酸ァンモニ ゥ厶， 炭酸アンモニゥム， 酢酸アンモニゥムなどの各種無機および有 機ァンモニゥム塩類あるいは尿素および他の窒素舍有物質たと.えばぺ プト ン， N Z -ァミ ン， 肉エキス， 酵母エキス ， コーン ♦ スチープ ' リカー， カゼィ ン加水分解物， フィ ッ シュ ミ ールあるいはその消化物、
    [0111] O PI WIPO 脱脂大豆粕あるいはその消化物， 蛹加水分解物などの窒素性有機物な ど種々のものが使用可能である。
    [0112] さらに無機物としては、 辚酸第一水素力 リ ウム， 燐酸第二水素力 リ ゥ厶， 硫酸アンモニゥム， 塩化アンモウ厶， 硫酸マグネシウム， 塩化 ナ ト リ ゥム， 硫酸第一鉄， 硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを 使用する。 微生物の生育に必要とするビタ ミ ン， ァミ ノ酸源などは、 前記したような他の培地成分に従って培地に供給されれば特に加えな くて-もよい。
    [0113] 培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件下に行う。 培養温度は一般に 2 0〜4 0 が好適である。 培養中の培地の p Hは 中性付近に維持することが望ましい。 培養期間は通常 1〜 5日間で培 地中に著量のァミ ノ酸が蓄積する。
    [0114] 培養終了後、 菌体を除去して活性炭処理、 イオン交換樹脂処理など の公知の方法で培養液からァミ ノ酸が回収-される。
    [0115] グルタ ミ'ン酸高生産能を有するいわゆるグルタ ミ ン酸生産菌は、 主 な菌学的性質を同じぐしているにもかかわらず、 産業上の重要性から 各研究者により、 種々の菌名が付されており属名までもコ リネバクテ リ ゥム属あるいはブレビバクテリ ウム属などさまざまである。 しかし ながら、 これらの菌群は、 細胞壁のアミ ノ酸構成や D N Aの塩基組成 が画一的であることから、 同一の菌種であることが指摘されていた。 さらに、 最近、 これらの菌種間には、 7 0〜 8 0 %以上の D N Aの相 同性があることが明らかにされ、 非常に近縁な微生物であることが明 白である C omatsu, Y. ： Repor t of t he Fermentat i on Resear ch I nst i tute, Na 55， 1 (1980) ， および， Suzuk i, K.， Kaneko, T.， and omagata, K. ： I nt. J. yst. Bacter i o l . , 31， 131 (1981)参照〕 。 上記の事実を踏まえれば、 本発明の有用性はグルタ ミ ン酸生産菌全 般にそのまま適用できることが容易に類推される。 組換え体 D N Aが これら菌種において安定に保持され、 発現されるためには D N Aの相
    [0116] O PI
    [0117] 寶0 同性等宿主菌の性質における若干の相違は問題でなく、 これら菌種が 当該プラス ミ ドの自律複製と導入遺伝子の発現を可能ならしめる機能 を有していればよい。 しかるに、 これらの菌種がこ両機能を共有して いることは、 本発明者らが、 先に特許出願 （特開昭 57 - 183799)したコ リネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム 2 2 5 — 2 5 0から分離され、 ス ト レプ ト マイ シンおよび/またはスぺクチノ マイ シン耐性遺伝子を有す るプラス ミ ド p C G 4がコ リ ネバクテ リ ゥ厶属およびブレビパクテ リ ゥム辱菌種等、 グ レタ ミ ン酸生産菌内で同じく複製でき、 また、 その 耐性遺伝子が発現される （特開昭 57- 186492)ことからあきらかである。 また本願のヒスチジンの製造において示すごと く、 コ リネバクテ リ ウ ム · グルタ ミ クムで発現する遺伝子がコ リネバクテ リ ゥム属、 ブレビ バクテリ ゥム属などの宿主菌において広く発現することが明らか ぁ る。 従って、 本発明を適用し得る宿主菌と しては、 コ リネバクテ リ ウ ム · グルタ ミ クムに限.らず、 コ リネバタテ リ ゥム属およびブレビバク テリ ゥム属菌種を含むグルタ ミ ン酸生産菌全てが包括される。
    [0118] 本明細書記載の菌株の国際寄託蕃号および寄託曰および移管曰は下 記のとおりである。
    [0119] FBRM P 寄託曰
    [0120] ATCC ( BP ) (移管曰） 年 月 日 し orynebacter ium glutamicum L-15 31834 1981. 3. 9
    [0121] ( ) Corynebacter i um hercul is し - 103 31866 1981. . 3
    [0122] ( ) Brevibacter ium d i var icatum L-204 31867 1981. . 3
    [0123] ( ) Brevibacterium lactof ermentum し -312 31868 1981. 4. 3
    [0124] ( ) Corynebacter ium glutamicum LA103/pCB54 39019 1981.12.11
    [0125] LA103/PCB101 39020
    [0126] 〃 LA103/pBthrl 39021
    [0127] LA103/PCG11 39022
    [0128] 〃 K17 39032 1981.12.21
    [0129] 〃 K18 39033 PERM P 寄託曰
    [0130] ATCC ( BP ) (移管曰） 年 月 B
    [0131] 〃 K19 39034 1981.12.21
    [0132] 20 39035 〃 31 39280 1983· 28
    [0133] Corynebacter ium glutam icum K32 39281 〃
    [0134] Corynebacter ium hercul is 33 39282
    [0135] Brevifaacter ium f luvum K34 39283
    [0136] Brevibacter ium lactof ermentum K35 39284
    [0137] Corynebacter ium glutam icum K37 39285 1983. 1.31
    [0138] 36 6908 1983. 2. 8
    [0139] ( 451) (1984. 1.19)
    [0140] 〃 H33 6909 1983. 2. 8
    [0141] ( 52) (1984. 1.19) C156 6910 1983. 2. 8
    [0142] ( 53) (1984. 1.19)
    [0143] 〃 38 7087 1983. 5.19
    [0144] ( 54) (1984. 1.19)
    [0145] Corynebacterium glutamicum 39 7088 1983. 5.19
    [0146] ( 459) (1984. 1.21) 40 7160 1983. 7.21
    [0147] ( 55) (1984. 1.19)
    [0148] // K41 7161 1983. 7.21
    [0149] ( 456) (1984. 1.19) K43 7162 1983. 7.21
    [0150] ( 57) (1984. 1.19) 44 7163 1983. 7.21
    [0151] ( 58) (1984. 1.19)
    [0152] 〃 45 7164 1983. 7.21
    [0153] ( 460) (1984. 1.21)
    [0154] Brevibacterium f luvum K42 (355) 1983. 9.12 Corynebacter ium glutam icum 46 (356) 1983. 9.12 Brevibacterium f luvum 48 (357) 1983. 9.12 Corynebacterium hercul is 47 (367) 1983. 9.21 Corynebacter ium glutamicum 49 (464) 1984. 1.25 図面の簡単な説明
    [0155] 第 1図は p G H 2の制限酵素切断パタ一ンを示す。
    [0156] 第 2図は p E t h r 1の制限酵素切断地図とそれの作製工程を示す, 破線で示した B g ^ H / B a m H I は両制限酵素切断で生じる同一接 着末端での連結部位である。 制限酵素切断地図作製に用いた制限酵素 は P s t I ， E c o R Iおよび X h o lである。 プラス ミ ドの分子量 はキロベースぺャ一 （ K b ) で表示されている。
    [0157] 第 3図は、 プラス ミ ド p E a r o F - 1の制限酵素切断パターンを 示す。
    [0158] 第 4図は、 プラス ミ ド p K m 1 a r 0 F 1の制限酵素切断パタ一ン を示す。
    [0159] 第 3， 4図中、 横の矢印は遺伝子の転写される方向を示してある。 第 5図は、 p E a r g 1の作製工程を示す。
    [0160] 制限酵素切断地図作製に用いた制限酵素は、 P s t I ， B a m H I および S a 1 Iである。
    [0161] 実施例 1.
    [0162] コ リネノ'クテ リ ゥム ·· 、'ルタ ミ クム C 1 5 6铢の L - ヒスチシジン 生合成に闋与する遺伝子のク口ーン化および該遺伝子の発現を利用し たコ リ ネノ クテ リ ゥム ♦ グルタ ミ クム， コ リ ネノ クテ リ ゥム · ノヽーキ ュ リ ス ， ブレビバクテ リ ウ厶 · フ ラブ厶およびブレビバクテ リ ウム · ラ ク ト フ アーノ ンタムによる L一ヒスチジンの生産 ：
    [0163] (1) コ リ ネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム C 1 5 6株の染色体 D N Aと プラス ミ ド p C G 1 1の調製 ：
    [0164] 1.2, 4 - ト リ ァゾール - 3 - ァラニン耐性で-ヒスチジン生産能を 有するコ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム C 1 5 6 ( F E R M P
    [0165] - 6 9 1 0 , F E R B P - 4 5 3 ) の染色体 D N Aを以下の方 法で調製した。
    [0166] 4 0 0 ml半合成培地 S S Mに種培養を接種して 3 0でで振盪培養 した。 種培養は N B培地を用いた。 東京光電比色計で 6 0 0 n mに おける吸光度 （ 0 D ) を測定し、 0 D 0.2になった時点で培養液中 0.5単位/ mlの濃度となるようにぺニシリ ン Gを添加した。 さらに
    [0167] O PI 培養を継続し◦ D約 0.6になるまで生育させた。
    [0168] 培養液から菌体を集菌し、 T E S緩衝液 〔0.0 3 M ト リス （ ヒ ド ロキメ チル） ァミ ノ メ タ ン一 H C ^ (以下ト リスと略す） 、 0.0 0 5 M E D T A , 0.0 5 M N a C ^ : p H8.0 , 以下同じ〕 で洗浄 後、 リゾチーム液 （ 12.5 %ショ糖， 0.1 M N a C ^ , 0.0 5 M ト リス、 0.8 mg / mlリゾチーム ： p H 8.0， 以下同じ） で 1 0 ml に懸濁し、 3 7 で 4時間反応させた。 集菌した菌体から斎藤らの 方法 〔Saito，H.et al: Biochim. Biophys. Acta, 72 619 (1963 ) 〕 に従って高分子染色体 D N Aを単離した。
    [0169] 一方、 ベクタープラスミ ドとして用いる p C G 1 1は、 コ リネバ クテリウム · グルタ ミ クム L— 2 2株の誘導株 L A 1 0 3の p C G 1 1保有株 L A l '0 3 / p C G l l ( A T C C 3 9 0 2 2 ) から次 のようにして単離した。
    [0170] • 4 0 0 mlN B培地で 3 0でで振盪培養し Q D約 0.7に'なるまで生 育させた。 菌体を集菌し、 T E S緩衝液で洗浄後、 リゾチーム液 1'0 mlに懸濁し、 3 7でで 2時間反応させた。 反応液に 5 M N a C £ 2.4 ml, 0.5 M E D T A ( p H 8.5 ) 0· 6 ml， 4 %ラウ リル硫酸 ナト リウムと 0.7 M N a C ·δからなる溶液 4.4 mlを順次添加し、 穏やかに混和してから氷水中に 1 5時間置いた。
    [0171] 溶菌物全体を遠心管に移し 4でで 6 0分間 69， 400 X gの遠心分離 にかけ上澄液を回収した。 これに重量百分率 1 0 %栢当のポリエチ レングリコール （ p E G ) 6, 0 0 0 (半井化学薬品社製） を加え、 静かに混和して溶解後、 氷水中に置いた。 1 0時間後 1, 5 0 0 X - で 1 0分間遠心分離してペレッ トを回収した。 T E S緩衝液 5mlを 加えてぺレッ トを静かに再溶解してから 1.5 mg/mlェチジゥムブロ マイ ド 2.0mlを添加し、 これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し 密度を 1.58 0に合わせた。 この溶液を 105， 000 X g， 1 8 で 4 8時間超遠心分離にかけた。 この密度勾配遠心により共有結合で閉 _ O PI , じられる環状の D N.Aは紫外線照射下に遠心チューブ中下方の密度 の高いバン ドとして見出された。 このバン ド画分を注射器で遠心チ ューブの側面から抜きとることによって P C G I 1 D N Aが分離さ れた。 ついで分画液を等容量のイ ソプロ ピルアルコール液 〔容量百 分率 9 0 %イ ソプロ ピルアルコール， 1 0 % T E S緩衝液 （この混 液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む） 、 以下同じ〕 で 5回処理 してェチジゥ厶ブ口マイ ドを抽出除去し、 しかる後に T E S緩衝液 に対して透析した。 かく して p C G 1 1 プラス ミ ド D N Aを得た。 (2) コ リ ネバクテ リ ゥム ' グルタ ミ クム C 1 5 6株のヒスチジン生合 成に関与する遺伝子のクローン化 ：
    [0172] 上記で調製した P C G 1 1 プラス ミ ド D N A 3 gおよび上記染 色体 D N A 9 ^ gを含む制限酵素 B g & Π用反応液 〔 1 0 m M ト リ ス （ p H 7. 5 ) , 7 m M M g C £ 2 , 6 0 m M N a C , 7 m M 2 ，メ ルカプトエタノ ール， 以下同じ〕 2 0 0 必に 1 0単位の B g ^ Π (宝酒造社製， 以下特記しない限り、 制限酵素は宝酒造社 製である） を添加し、 3 7 で 6 0分間反応後、. 6 5 でで 1 0分間 加温して反応を停止させた。 この混合消化物に T 4 リガーゼ用緩衝 液 I ( ト リ ス 2 0 0 m M M g C £ 2 6 6 m , ジチオス レイ ト 一 ル l O O m M , p M 7. 6 , 以下同じ） 4 0 ， 5 m M. A T P溶 液 4 0 〃 T 4 リガーゼ （宝酒造社製， 1単位/ ; « ， 以下同じ） Q. 3 £および水 1 2 0 ί £を加え、 1 2 °Cで 1 6時間反応させた。
    [0173] T 4 リガーゼ反応液混合物をコ リネバクテ リ ウム · グルタ ミ ク厶 L H 3 3株 （ ヒスチジン要求性， リゾチーム感受性） の形質転換に o
    [0174] 形質転換は L H 3 3株のプロ トプラス トを用いて行った。 L H 33 株の種培養を N B培地に植菌し 3 0 でで振盪培養した。 0 D 0. 6 に - なった時点で集蘭し、 該細胞を R C G P培地に 1 rag/mlのリゾチー ムを含む液 （ p H 7. 6 ) に約 1 0 3 細胞/ mlとなるように懸濁し、 L型試験管に移して 3 0でで 5時間緩やかに振盪反応してプロ トプ ラス トイ匕した。
    [0175] このプロ トプラスト懸濁液 0. 5 mlを小試験管にとり 2. 5 0 0 x g で 5分間遠心分離し、 T S M C緩衝液 （ 1 0 m M塩化マグネシゥム， 3 0 m M塩化カルシウム， 5 0 m M ト リス， 4 0 0 m Mショ糖， p H 7. 5 , 以下同じ） 1 mlに再懸濁して遠心洗浄後、 T S M C緩衝 液 0. 1 mlに再懸濁した。 この懸濁液に 2倍濃度の T S M C緩衝液と 上記 ')ガーゼ反応 D N A混合物の 1対 1混合液 1 0 0 ^ ^を加えて 混和し、 次いで T S M C緩衝液中に 2 0 % P E G 6, 0 0 0を含む液 0. 8 mlを添加して混合した。 3分後、 R C G P培地 （PH7. 2 ) 2 ml を添加し、 2. 5 0 0 X gで 5分間遠心分離にかけて上澄み液を除去 し、 沈降したプロ トプ.ラス トを 1 mlの R C G P培地に懸濁してから 0. 2 mlをスぺクチノマイシン 4 0 0 〃 g / ralを含む R C G P寒天培 地 （ R C G P培地に 1. 4 %寒天を含む培地， p H 7. '2 ) に塗抹し、 3 0でで 7日間培養した。
    [0176] 選択プレート上に生育したスぺクチノマイ シン耐性コロニーをか き集め、 生理.食塩水を用いて 2回遠心洗浄後、 スぺクチノマイシン 1 0 0 g / mlを含む最小寒天培地 M 1 〔グルコース 1 0 g， N H 4 H 2 P 04 1 g , K C £ 0. 2 g， M g S O 4 * 7 H 2 O 0. 2 g , F e S 04 ♦ 7 H 2 0 1 0 nig , M n S O 4 * 4〜 6 H 2 O 0. 2 rag Z n S 04 - 7 H 2 0 0. 9 mg , C u S 04 - 5 H 2 0 0. 4 mg , N a 2 B 4 O 7 * 1 0 H 2 O 0. 0 9 mg , ( N H 4 ) 6 M o 7 0 24 • 4 H 2 0 0. 0 4 rag， ピオチン 5 0 z g , p —ァ ミ ノ安息香酸 2. 5 rag , サイ了 ミ ン塩酸塩 1 mg， 寒天 1 6 gを 1 ·2中に含む ρ Η 7. 2 に調整した培地， 以下同じ〕 に塗布して 3 0でで 2日間培養し、 ス ぺクチノマイ シン耐性でかつヒスチジン非要求性となった形質転換 株を選択した。 形質転換株の 1株から上記第 1項記載のェチジゥム ブロマイ ド · セシウムク ロライ ド密度勾配遠心によりプラス ミ ドを
    [0177] OMPI 単離した。 各種制限酵素による単独消化および 2種類の制限酵素に よる二重消化で生成する D N A断片をァガロースゲル電気泳動で解 析しこのプラス ミ ド D N Aの制限酵素切断様式を同定した。 このプ ラス ミ ドを p P H 8 と命名した。 p P H 8は p C G l lの B g ^ II 切断部位に約 1 0. 6 K bの D N A断片が挿入された構造であった。
    [0178] さらに P P H 8 D N Aを用いて H 3 3株 〔L H 3 3株の親株 （ ヒ スチジン要求性， リ ゾチーム耐性） ： F E R M P — 6 9 0 9 ， F E R M B P — 4 5 2 ) を再形質転換したところスぺクチノ マイ シン耐性株として選択される形質転換体のすべてがヒスチジン非要 求铨となっていた。 これらのことより、 ヒスチジン生産菌 C 1 5 6 株のヒスチジン生合成に関与する遺伝がク口 - ン化されていること が明白である。
    [0179] ヒスチジン生合成に闋与する遺伝子のク 口 -ニングは最初か'ら H 3 3株を宿主菌株として用いて行うこともできる。 · (3) p P H 8 ½·保有するコ リネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム菌株によ る L - ヒスチジンの生産 ：
    [0180] コ リ ネバクテ リ ウ厶 · グルタ ミ クム L A — 1 0 3株を p P H 8 D N Aで形質転換し、 スぺクチノ マイ シン 4 0 0 〃 g /mlを含む C G P寒天培地上で同薬剤耐性.の形質転換株を選択した。 得られ た形質転換株は 3 mg/mlの 2 -チアゾールァラニンを含む最小培地 上で耐性を示した。 純化後、 上記と同様にプラス ミ ド単離構造解析 を行って、 p P H 8 と同じ構造のプラス ミ ドであることを確認した。
    [0181] p P H 8保有株コ リネバタテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム L A 1 0 3 ん p P H 8は米国ァメ リ カ ン * タイ プ · カルチヤ - ' コ レク ショ ンに し orynebacter i um glutamicum K 32 , A T C C 3 9 2 8 1 と して 寄託されている。 ·
    [0182] コ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム L A 1 0 3 / p C G 1 1 ( ATCC 39022 ) および同 L A 1 0 3 / D P H 8 ( A T C C 39281 )
    [0183] _ OMPI の L -ヒスチジン生産試験を以下のとおり行った。
    [0184] N B寒天培地上で 3 0 一晩培養した上記の菌をそれぞれ 1白金 耳ずつ 2 0 0 g /tnlのアルギニンおよびメチォニンを補った 5 ml の生産培地 P 5 〔糖蜜 1 2 % (糖として） 、 K H2 P 04 Q.2 % , K 2 Η Ρ 04 0. l % , g S 04 · 7 Η2 0 0.0 5 %， NaC 0.2 5 % , ( Ν Η4)2 S 04 2.3 % , 尿素 0.2 % , C a C 03 2 % , ρ Η 7.4 (アンモニアで調整） ， 以下同じ〕 に植菌した。
    [0185] 3 0。Cで 7 5時間培養後、 培地中の L -ヒスチジン生成量をスル ファニル酸 （ポ - リ - ） 試薬を用いる比色法 〔 H. Pauly, Hoppe- Seylers; Z. Physiolo. Chem. , 4 2 ， 5 0 8 ( 1 9 0 4 ) ， 同 94 2 8 4 ( 1 9 1 5 ) 3 によって定量した。 結果を第 1表に示す。
    [0186] 第 1 表 菌. .株. ，. - L一 ヒスチジン （mg/ml)
    [0187] L A 1 0 3 / p C G 1 1 0
    [0188] L A 1 0 3 / p P H 8 ( K 3 2 ) 2.6
    [0189] (4) p P H 8を保有するコ リネバクテリ ゥム ' ノヽ —キユ リス， ブレビ バクテ リ ゥ厶 · フラブムおよびブレビバタテ リ ゥ厶 · ラク ト ファ ー メ ンタ厶による L -ヒスチジンの生産：
    [0190] コ リ ネバタ リ ウム · ノ、ーキユ リ ス A T C C 1 3 8 6 8 ， ブレビハ クテ リ ゥム * フラブム A T C C 1 4 0 6 7およびブレビパクテ リ ウ ム * ラ ク ト フア ーメ ンタム A T C C 1 3 8 6 9にプラス ミ ド p P H 8を保有せしめるために、 各菌株を受容菌として形質転換株を行つ ノ 0
    [0191] 各菌珠を S S M培地で増殖させ、 0 D 6 6 0 nmが 0.2になったと きにぺニシリ ン Gを 0.3単位/ mlとなるように添加した。 培養を続 け、 ◦ D 6 6 0が 0.6まで増加したところで集菌し、 1 mg/mlリゾ
    [0192] ' 〇M I チ -ムを含む R C G F培地中で上記の記載と同様にプロ トプラス ト 形成させた。 p P H 8を用い、 上記の方法に従い形 転換を行い、 形質転換株をスぺクチノ マイ シン 4 0 0 g /nilを含む R C G P寒 天培地上で生育するコ ロニ -として選択した。 ―
    [0193] 純化したスぺクチノマイ シ ン耐性形質転換株の培養菌体よりブラ ス ミ ド D N Aを特開昭 5 7 - 1 8 3 7 9 9 ， 同 5 7 - 1 3 4 5 0 0 の記載に従って調整し、 これらが p P H 8と同じ構造を有すること が制限酵素切断様式より確認ざれた。 以上のことから、 プラス ミ ド p C G 1 1の誘導体であるプラス ミ ド p P H 8はコ リネバクテ リ ウ ム ♦ ハ ーキュ リ ス ， ブレビノ ク テ リ ゥム · フ ラ ブ厶およびブレビパ' クテ リ ゥ厶 · ラタ ト ファ -メ ンタム中でも複製可能であり、 プラス ミ ド p C G 1 1が広く これら菌種の細菌で使用可能であることがわ カヽっプ^。
    [0194] ' P H 8保有株であるコ リネパクテ リ ゥム · ハ—キュ リズ K 3 3 , ブレビバクテ リ ゥム ♦ フラブム K- 3 4 ， およびブレビバクテ リ ゥム • ラク ト フ ァ — メ ンタ ム K 3 5はそれぞれ米国ァメ リカ ン · タイ プ ， カルチャ ー · コ レク シ ョ ンに A T C C 3 9 2 8 2 , 3 9 2 8 3 および 3 9 2 8 4として寄託されている。
    [0195] これら菌株による L -ヒスチジン生産試験を次のように行った。 N B寒天培地上で 3 0 晩培養させた p P H 8保有株およびそ れらの親株をそれぞれ 1白金耳ずつ 5 mlの生産培地 P 5に植菌した。 3 0 で 7 5時間振盪培養後、 培地中の L -ヒスチジン生産量を ポ - リ -法によって比色定量した。 結果を第 2表に示す。 AAAAAA
    [0196] τττττ
    [0197] 株 L— ヒスチジン
    [0198] ( mg/ ml )
    [0199] C C 13868 0
    [0200] C C 13868 / p P H 8 ( K33, ATCC39282) 2.4
    [0201] C C 14067 0
    [0202] C C 14067 / p P H 8 ( 34, ATCC39283) 3.0
    [0203] C C 13869 0
    [0204] T C C 13869 / p P H 8 ( 35, ATCC39284) 2.0 以上より、 コ リネバクテリ ゥ厶 . グルタ ミ ク厶由来のヒスチジン 生合成に闋与する遺伝子がコ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム以外 にコ リネノ クテ リ ゥ厶 · ノヽ 一キユ リ ス， .ブレビノ クテ リ ゥ厶 · フラ ブ , ブレビバクテ リ ウ厶 ♦ ラク ト ファ ―メ ンタムの諸菌種におい て発現し、 ヒスチジンの生産に寄与していることが明らかであつた。 実施例 2. '
    [0205] 大腸菌 K 1-2株 ¾株 Aで（： 2 3 7 '4 0のし— ヒスチジン生合成に 関与する遺伝子を含む組換え体プラス ミ ドの作製、 同プラス ミ ドへの 1 , 2 , 4 - ト リァゾ-ル- 3 -ァラニン耐性突然変異の付与ならび に該突然変異誘起プラス ミ ドを ♦保有しめたコ リネバクテ リ ウ厶 · グ ルタ ミ クムによる L - ヒスチジンの生産 ：
    [0206] (1) 大腸菌 1 2株亜株 A T C C 2 3 7 4 0の染色体 D N Aとプラ ス ミ ド P C E 5 3の調整：
    [0207] 大腸菌の高分子染色体 D N Aはヒスチジンに闋して野性型の大腸 菌 K 1 2株亜株 ATCC 2 3 7 4 0の培養菌体からス ミ スのフニノ - ゾレ抽出法 [Smith, M. G. ： Methods in Enzymology 1 2 PartA. , 545(1967)] に従い単離した。
    [0208] ベクタープラス ミ ドとして用いる p C E 5 3は同プラス ミ ドを保 有する大腸菌 Κ 1 2株亜株 M M 294/P C E 53の培養菌体からアンら の方法 〔 An, G. et al.， ： J. Bacter iol. , 140, 400 (1979) 〕 に 従い単錐した。 M M 2 9 4 / p C E 5 3は次のような工程で造成し
    [0209] O Pl_ o" た。 コ リ ネノ クテ リ ゥ厶 . グルタ ミ クム L A 1 0 3 / p C E 5 3の 培養菌体から前記の方法でブラス ミ ド D N Aを単離し、 大腸菌 1 2株亜株 M M 2 9 4 [Miiller-Hill, B. et al_. , in Protein
    [0210] Ligand Interactions, eds. Sund, H. and Blauer, G. p211 (1975) 〕 の形質転換に供した。 M M 2 9 4株のコ ンピテ ン ト · セルはダジェ ルト らの方法 〔 Dagert, M. et al. , Gene 6 23 (1979)] に従つ て調製した。 カナマイ シン 2 5 g / mlを含む L寒天培地 （バク ト ト リ プ ト ン 1 0 g , 酵母エキス 5 g， 塩化ナ ト リ ウム 5 g， ブドウ 糖 1 gおよび寒天 1 & gを水 1 £に含み、 p H7.2 に調整した培地） 上に生育したカナマイ シン耐性形質転換体の 1株を単集落分離した 後、 同株の培養菌体からプラス ミ ド D N Aを上のアンらの方法に従 つて単離した。 ブラス ミ ド D N Aの構造を制限酵素切断様式から解 析し、 もとの P C E 5 3と同一構造を有していることを確認した。
    [0211] コ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ 'ミ クム L A 1 0 3 / C E 5 3は次 のようにして造成した。 プラス ミ ド' p C G lの B g l H切断産物と P G A 2 2の B a m.H I部分切断産物を T 4 リガーゼ （宝酒造社顰） を用いて連結せしめた。 同連結物を用いてコ リネバクテ リ ゥム · グ ルタ ミ クム L A 1 0 3株を特開昭 57- 186492および 57- 186489記載 の方法に従って形質転換した。 カナマイ シン耐性形質転換体は 100 z g /mlのカナマイ シンを含む RCGP 寒天培地上で選択した。
    [0212] 同薬剤耐性の形質転換体の一株からプラス ミ ド D N Aを単離し、 制限酵素切断により構造を解析した。 同プラス ミ ドは P G A 2 2の カナマイ シン耐性を規定する遺伝子近傍の B a m H I切断部位に
    [0213] P C G 1が揷入された構造を有していた。 本プラス ミ ドを p C E53, P C E 5 3を含んだ形質転換体を L A 1 0 3 / P C E 5 3と命名し
    [0214] o
    [0215] (2) 大腸菌 A T C C 2 3 7 4 0のヒスチジン生合成に関与する遺伝子
    [0216] のクローン化 ：
    [0217] Ο ΡΙ 前項で記載した方法に従って調製した P C E 5 3プラスミ ド D N A 3 gおよび大腸菌染色体 D N A 9 gを含む制限酵素 P s t I 用反応液 〔 2 0 m M ト リス （ p H 7.5 ) 、 1 0 mM M g C £ 2 ,
    [0218] 5 0 mM (MA) 2 -S04, 0.0 1 %ゥシ血清アルブミ ン以下同じ〕 200
    [0219] ^に 1 0単位の P s t Iを添加し、 3 7 "Cで 6 0分間反応せしめ た後、 6 5でで 1 0分間加温して反応を停止させた。 この混合消化 物に T 4 リガーゼ用緩衝液 1 4 0 ^、 5 mM A T P溶液 40〃 £、 T 4 リガーゼ 0.3 ^および水 1 2 0 j " を加え、 1 2でで 1 6時 間反応させた。 T 4 リガーゼ反応混合物を大腸菌 K 1 2株亜株 J C 4 1 1 〔hisG， leuB, argG, metB ： Clark et al. , Mole Gen.
    [0220] Genet. 105^_ 1 (1969) 〕 の形質転換に供した。
    [0221] J C 4 1 1のコ ンビテン ト · セルはダジヱルト らの方法 〔 Dagert, M. et al.， ： Gene _6_, 2 3 ( 1 9 7 9 ) ] に従って調製し.た。 即ち、 L — b r 0 t h 〔バク ト.ト リプト ン 10 g、 酵母エキス 5· gお- よび塩化ナ ト リウム 5 gを水 1 に含む培地 （以下し Bという） 〕 ( H 7.2 ) 5 0 mlに J C 4 1 1株を植菌し、 対数期中期まで 37で で振盪培養した。 培養液を氷水中で 1 0分間冷却してから遠心集菌 した。 冷却した 0. 1 M塩化カルシウム 2 0 mlに菌体を再懸濁し、 0 でに 2 0分藺置いた。 再び遠心集菌した後、 0. 1 M冷塩化カルシゥ ム 0.5 mlに再懸濁し、 0でで 1 8時間置いた。 塩化カルシウム処理 した菌液 1 5 0；« ^前記リガーゼ反応混合物 5 0 £を加え、 0 1 0分間放置後、 3 7でで 3分間加温した。 L培地 2 mlを加え 3 7 :で 2時間振盪培養した。 生理食塩水で 2回遠心洗浄後、 各 5 0 g / mlのロイ シン， 了ルギニン， メ チォニンおよび 2 / mlの カナマイ シンを添加した A寒天培地 〔Na2HPQ4 8g , KH2P04 2 g , (NH4)2S04 lg, MgS04- 7H2Q O. lg, サイアミ ン塩酸塩 4 ral， ブ ドウ糖 1 0 gおよび寒天 1 6 gを水 1 に含み、 p H 7.2に調整し た培地 （以下同じ） 〕 に塗布し、 3 7でで 3日間培養した。 出現し
    [0222] 0MP1 た形質転換株の培養菌体から前項と同様の方法によってブラス ミ ド D Aを単離した。 単離したプラ ス ミ ド D N Aを制限酵素切断とァ ガロースゲル電気泳動法により解析した結果約 4.8 K bの Pst I D N A断片が p £ 5 3の唯 1カ所の？ 3 1： 1切断部位に挿入した構 造を有していることがわかった。 このプラス ミ ドを p E G 7と命名 した。
    [0223] J C 4 1 1株から前記と同様の方法によりコ ン ビテ ン ト · セルを 調製し P E G 7 D N Aを用いて形質転換した。 カナマイ シン 25 / g /mlを舍む N B栄養寒天培地上に生育した形質転換株は全てヒスチ ジン非要求性となっていたことから、 P E G 7プラス ミ ドには J C 4 1 1株の h i s G欠損変異を相補する活性が存在することが明白 でめ 0
    [0224] (3) プラス ミ ド p E G 7のコ リネノ クテ リ ゥム · グルタ ミ クムへの導 入 ： .
    [0225] P E G 7プラス ミ ド D N Aを用いてコ リネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ ク ム L H 7 3株 （ ヒスチジン要求性、 リ ゾチーム感受性） を形質 転換した。 形質転換は L H 7 3株のプロ トプラス トを用いて実施例 1 (2)と同様の方法で行った。 カナマイ シン 2 0 / mlを含む RC
    [0226] GP寒天培地上に生育したカナマイ シ ン耐性形質転換体から調製した プラス ミ ドは p E G 7と同じ構造を有していることが制限酵素切断 様式から確認された。 またカナマイ シン形質転換体は全てヒスチジ ン非要求性となっていた。 これらのことから大腸菌由来のヒスチジ ン生合成に関与する遺伝子がコ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クムに おいても発現することが明白である。
    [0227] (4) プラ ス ミ ド p E G 7へのヒスチジンアナログ 1， 2， 4- ト リ ァゾ ール - 3 -ァラニン耐性突然変異の付与 ：
    [0228] 前項で造成した P E G 7を保有するコ リネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム LH73/PBG7 株を常法によりニ ト ロソグァニジンで変異誘起し、 一 O PI / WIPO 1 rag /mlの 1， 2， .4— ト リ ァゾールー 3 -ァラニン （以下で R Aと 略す） を含む最小寒天培地 M 1 に塗布した。 3 0でで 5 日間培養後、 出現したコ ロニーをかき集め、 生理食塩水に懸濁した。 この菌液を カナマイ シン 2 5 g / mlを含む栄養培地 N Bに約 1 0 7 細胞/ ml となるように植菌し、 3 0でで 1晩振盪培養した。 培養菌体から実 施例 1 (1)項記載の方法に従ってプラス ミ ドを単離した。 単離した混 合プラス ミ ドを用いてコ リネバクテリ ウ厶 · グルタ ミ ク厶 L H73株 を再形質転換した。 得られた力ナイ シン耐性形質転換体のうち T R Aに対する耐性形質を獲得した 1株からプラス ミ ドを単離した。 同 プラス ミ ドは p E G 7 と同一の制限酵素切靳様式を有していた。 こ プラス ミ ドを p E G 7 t l 8 0 と命名した。
    [0229] (5) .p E G 7 t l 8 0の 4.8 K b P s t l. D N A断片のサブクロー ニング ：
    [0230] T R A耐性突然変異が大腸菌染色体に由来する 4..8 K b P s t I D N A断片上にあることをさらに確認するために同 D N A断片の サブクロ一二ングを行った。 それぞれ の p E G 7 t l 8 0お よび p C G l 1 D N Aを P s t Iで切断した後、 T 4 リガーゼを用 いて連結した。 D N A連結物を用いてコ リネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム L A 1 0 3株を実施例 1 (2)項記載と同様な方法によって形質 転換した。 得られたスぺクチノ マイ シン耐性形質転換体を 1 rag /ml T R Aおよび各 5 0 g / mlのアルギニン， メチォニンを舍む A寒 天培地、 2 5 g / mlのカナマイ シンを含む N B寒天培地ならびに 100 μ g / mlのスぺクチノマイ シンを含む N B寒天培地に順次塗布 した。 3 0でで 5 日間培養後スぺクチノマイ シンおよび T R Aに耐 性でカナマイ シンに感受性を示した 1株を選び、 純化後、 培養菌钵 からプラス ミ ドを単離した。 同プラス ミ ドの制限酵素切断様式から、 このプラス ミ ドは p C G l lの P s t l切断部位に 4.8 K bの P s t I D M A断片が挿入している構造を有していることがわかった。
    [0231] OMPI 同プラス ミ ドを p C S t 1 8 0 と命名した。
    [0232] p C S t 1 8 0 D N Aを用いて L H 7 3株を再形質転換したとこ ろ、 得られたスぺクチノ マイ シ ン耐性形質転換株は全てヒスチジ ン 非要求性であった。 さらにアルギニン， メチォニンをそれぞれ 200 μ g / ml補った生産培地 P 5を用いてコ リネバクテリ ウム ♦ グルタ ミ ク 厶 L A 1 0 3 / P E G 7 , L A 1 0 3 / p E G 7 t l 8 0 , L A 1 0 3 / P.C G 1 1 ( A T C C 3 9 0 2 2 ) および L A 1 0 3 / p C S t 1 8 0株（K - 49)の L - ヒスチジン'生産試験を行った。 3 0 7 5時間培養後、 培地中に蓄積した L - ヒスチジンを実施例 1 (3)項に示した方法で比色定量した。 結果を第 3表に示す。
    [0233] 第 3 表 株 L 一 ヒスチジン （ mg/ml ) し A 1 0 3 / p E G 7 0
    [0234] L A 1 0 3 /· - E G 7 t 1- 8 0 1. 8
    [0235] L A 1 0 3 / p C G 1 1 0
    [0236] L A 1 0 3 / p C S t 1 8 0 · '2. 0 これらのことから大腸菌染色体由来のヒスチジン生合成に関与す る遺伝子を舍む 4. 8 Kb P s t I D N A断片上に T A耐性突然変 異が存在し、 同 D A断片上の遺伝子発現によりコ リ ネバクテ リ ゥ ム · グルタ ミ クムを用いて L - ヒスチジンが生産されることが示さ. れた。
    [0237] L A 1 0 3 / p C S t l 8 0株は工業技術院微生物工業研究所に コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K 4 9 F E R M — B F 4 6 4 と して寄託されている。
    [0238] 実施例 3 .
    [0239] ブレビノ ク テ リ ゥ厶 · フ ラバム A T C C 1 0 6 7のア ンス ラニル 酸合成酵素遺伝子のコ リ ネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クムでのク ローン 化と ト リプト ファ ンの生産 ：
    [0240] OMPI (1) 染色体 D N Aとブラスミ ド p C E 5 3の調製法： ブレビバクテ リ ゥム · フラバム A T C C 1 0 6 7の染色体 D N Aを以下の方法で調製した。
    [0241] 4 0 O ml半合成培地 S S Mに種培養を接種して 3 0でで振盪塔養 した。 種培養は N B培地を用いた。 東京光電比色計で 6 6 0 n mに おける吸光度 （ 0 D ) を測定し、 0 D 0. 2になった時点で培養液中 0. 5単位/ nilの濃度となるようにぺニシリ ン Gを添加した。 さらに 培養を継続し 0 D約 0. 6になるまで生育させた。
    [0242] 培養液から菌体を集菌し、 T E S緩衝液で洗浄後、 リゾチーム液 ( 2 5 %ショ糖、 0. 1 M N a C . 0. 0 5 M ト リ ス、 0.8 mg/nil リゾチーム ： p H 8. 0、 以下同じ） で 1 0 mUこ懸濁し 3 7 で 4時 反応させた。 集菌した菌体から斉藤らの方法に従って高分子染色 体 D N Aを単離した。
    [0243] ぺグターとして用いる p C E 5 3は次の方法でその保有株コ リネ パクテリウム ·グルタ ミタム L-- 2 2株の培養菌体から単離した。
    [0244] 4 0 0 mlN B培地で 3 0 :で振盪培養し 0 D約 0. 7になるまで生 育させた。 菌体を集菌し、 T E S緩衝液で洗浄後、 リゾチーム液 10 mlに懸濁し、 3 7でで 2時間反応させた。 反応液に 5 M N a C 2.4 ml、 0. 5 M E D T A ( p H 8. 5 ) 0. 6 4 % ラウ リル硫酸 ナ ト リ ウムと 0. 7 M N a C &からなる溶液 4.4 mlを順次添加し、 穏やかに混和してから氷水中に 1 5時間置いた。
    [0245] 溶菌物全体を遠心管に移し 4でで 6 0分間 69， 400x gの遠心分離 にかけ上澄液を回収した。 これに重量百分率 1 0 %相当のポリェチ レンダリコール （ P E G ) 6. 0 0 0 (半井化学薬品社製） を加え静 かに混和して溶解後、 氷水中に置いた。 1 0時間後 1, 5 0 0 X gで 1 0分間遠心分離してペレツ トを回収した。 £ 3緩衝液5 (111を加 えてペレツ トを静かに再溶解してから 1. 5 mg/ mlェチジゥムブロマ ィ ド 2. 0 mlを添加し、 これに^化セシウムを加え静かに溶解し密度
    [0246] OMPI を 1.5 8 0に合わせた。 この溶液を 105， OOOx g、 18'Cで 4 8時間 超遠心分離にかけた。 この密度勾配遠心により共有結合で閉じられ た環状の D N Aは紫外線照射下に遠心チューブ中下方の密度の高い バンドとして見出された。 このバン ド画分を注射器で遠心チューブ の側面から抜きとることによって P C E 5 3 D N Aが分離された。
    [0247] 次いで分画液を等容量のィ ソプロ ピルアルコール液 〔容量百分率
    [0248] 9 0 %イ ソプロ ピルアルコール、 1 0 % T E S緩衝液 （ この混液中 に飽和溶解量の塩化セシウムを含む） 〕 で 5回処理してェチジゥム プロマイ ドを抽出除去し， しかる後に T E S緩衝液に対して透析した , p C E 5 3は本発明者らが先に特許出願したコ リネバクテ リ ゥム • グルタ ミ クムのプラス ミ ド p C G l (特開昭 5 7 - 1 3 4 5 0 0 ) と大腸菌のプラス ミ ド P G A 2 2 CAn, G. et al： J. Bacteriol.140, 400 (1979)参照〕 を和合連結せしめたプラス ミ ドである。 詳しく は ·· p C G 1上に 1力所しかない B g ^ Π切断部位と P G A 2 2上に 2 力所ある B a m H I切断部位のうちテ ト ラサイ ク リ ン耐性遺伝子内 でない B a m H I切断部位とで、 両制限酵素同一接着末端を利用し て連結したものである。 P C E 5 3は p G A 2 2由来のカナマイ シ ン耐性遺伝子などの選択マーカーを有し、 制限酵素 S a 1 I に対す る切断部位は 1力所である。
    [0249] (2) ア ンス ラ ニル酸合成酵素遺伝子のク ロ ー ン化 ：
    [0250] 上記で調製した P C E 5 3プラス ミ ド D N A 3 " gおよび染色体 D N A 9 i gを含む制限酵素 S a i l反応液 2 0 0 に 1 0単位 の S a 1 Iを添加し、 3 7 °Cで 6分間反応後、 6 5 °Cで 1 0分間加 温して反応を停止させた。 この混合消化物に T 4 リガーゼ用緩衝液 H ( ト リ ス 6 6 0 m M、 g C 2 6 6 m M : ジチオス レィ ト ール
    [0251] 1 0 0 m Μ ρ Η 7· 6、 以下同じ） 4 0 、 A T P ( 5 m M ) 40 ^ 、 T 4 リガーゼ 0.4 ·βおよび H20 1 2 0 £を加え.、 1 2 でで 1 6時間反応させた。
    [0252] OMFI
    [0253] /Λ WIPO 、 ノ (3) 組換え体プラスミ ドの形質転換：
    [0254] このリガーゼ反応混合物を形質転換に洪した。 形質転換する受容 菌としてコ リネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム L — 2 2株から誘導さ れたアンス ラ ニル酸要求性変異株 L A 1 0 5 (アンス ラニル酸合成 酵素欠損変異株） を用いた。 アンス ラニル酸要求性変異株は、 常法 の変異処理により、 M 1寒天培地上で生育できず、 アンスラニル酸 ( 0 ^ 8 / ml相当） を補った M 1寒天培地上で生育できる菌を選 択することによって取得された。 L A 1 0 5株のプロ トプラス トの 調製および形質転換は、 生育培地 N Bに 1 0 0 g / ml相当のァン スラニル酸を捕った培地に生育した L A 1 0 5の菌体を使用して以 下のとおりに行った。
    [0255] L A 1 0 5株の種培養を N B培地に植菌し 3 0でで振盪培養した。 0 D 0.6になった時点で集菌し、 該細胞を R C G P培地に 1 mg/inl のリゾチ -ムを舍む液 （ p H 7. & .) に約 1 0 3 細胞/ mLとなるよう に懸濁し、 L型試験管に移して 3 0でで 5時間緩やかに振盪反応し てプロ ト ス ラ ス ト化した。
    [0256] このプロ ト ス ラスト懸篛液 0. 5 mlを小試験管にとり 2. 5 0 0 x g で 5分間遠心分離し、 T S M C緩衝液 1 mlに再懸濁して遠心洗浄後、 T S M C緩衝液 0. 1 mlに再懸濁した。 この懸濁液に 2倍濃度の T S M C緩衝液と上記リガ-ゼ反応 D N A混合物の 1対 1混合液 1 0 0 μ を加えて混和し、 次いで T S M C緩衝液中に 20% P E G 6, 000 を含む液 0.8 mlを添加して混合した。 3分後、 1 〇 0 培地 （ 11 7. 2 ) 2 mlを添加し、 2. 5 0 0 X gで 5分間遠心分雜にかけて上澄 み液を除去し、 沈降したプロ トプラス トを 1 mlの R C G P培地に懸 蜀してから 0. 2 mlをカナマイ シン 3 0 0 〃 g / mlを含む R C G P寒 天培地 （ R C G P培地に 1. %寒天を含む培地， p H 7. 2 ) に塗抹 し、 3 0でで 7日間培養した。
    [0257] 選択プレ- ト上に生育したカナマイシン耐性コロニ-をかき集め、
    [0258] O FI 生理食塩水を用いて 2回遠心洗浄後、 カナマイ シン を 会む最小寒天培地 M 1に塗希して 3 0 °Cで 2 日間培養し、 カナマイ シン耐性でかつア ンスラニル酸穽要求性となった形質 fe換株を選択 しプ ν·* 0
    [0259] これらの形質転換株を培養菌体から前記と同様にプラス ミ ド D N Aを単離した。 形質転換株の一株から得られたプラス ミ ド p T r p 2 - 3を各種制限酵素消化後ァガロ -スゲル電気泳動で解析した結 果、 p C E 5 3の唯一の S a 1 1切断部位に約 7.1 K bの S a 1 I D A切断片が挿入されたプラス ミ ドであることがわかった。
    [0260] P T r p 2 - 3を用い、 同様な方法で L A 1 0 5株を再形質転換 したところ、 ト リブトフ ァ ン 1 0 0 i g /nilおよびカナマイ シ ン 400 μ g / mlを含む R C G P寒天培地上で生育するコロニ -は、 '同時に アンス ラ ニル酸非要求性となり、 それらは、 S a 1 Iの切断様式で 判定される P T r ρ 2 - 3と同一のプラス ミ ドを保有していた。
    [0261] 以上の結果は、 クロ - ン化された約 7.1 K bの S a l l D N A切 断片にはブレビバクテ リ ゥ厶 · フラブム A T C C 1 4 0 6 7のアン ス ラ ニル酸合成酸素をコ― ドする遺伝子が存在し、 それがコ リ ネバ クテリ ウム · グルタ ミ クム L A 1 0 5株中で発現していることを示
    [0262] P T r p 2 - 3保有菌株は米国ァメ リカ ン · タ イ プ - カルチヤ - • コ レク シ ョ ンに Corynebacterium glutamicum K 2 0 ， A T C C 3 9 0 3 5と して寄託されている。
    [0263] (4) 形質転換株による ト リブト フ ァ ンの生産 ：
    [0264] プラ ス ミ ド p C E 5 2を用いて上記と同様の処理を行い、 ブレビ ノ ク テ リ ゥ厶 ♦ フ ラバム A T C C 1 4 0 6 7のアンス ラ ニル酸合成 酵素をコ - ドする遺伝子を有するブラス ミ ド p T r p 4 - 3を得た。
    [0265] P C E 5 2は本発明者らが先に特許出願したコ リネバクテ リ ウム - グルタ ミ ク ムのプラ ス ミ ド p C G l (特開昭 5 7 - 1 3 4 5 0 0 )
    [0266] OMFI と大腸菌のプラス ミ ド P G A 2 2 〔 An. G. et aj, ： J. Bacteriol. 140, 400 (1979) 参照〕 を和合違結せしめたプラス ミ ドである。 詳 しく は ： p C G l上に 1力所しかない B g ^ Π切断部位と p G A 2 2 上に 2力所ある B a m H I切断部位のうちテ ト ラサイ ク リ ン耐性遺 伝子内の B a m H I切靳部位とで、 両制限酵素の同一接着末端を利 用してし連結したものである。 P C E 5 2は P G A 2 2由来のカナ マイ シン耐性遺伝子などの選択マ -力 -を有し、 制限酵素 Sal Iに 対する切断部位は 1力所である。
    [0267] p C E 5 2保有株コ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム L— .2 2株 の培養菌体から次の方法で P C E 5 2を単離した。
    [0268] 4 0 0 mlN B培地で 3 0でで振盪培養し 0 D約 0.7になるまで生 育させた。 菌体を集菌し、 T E S緩衝液で浼浄後、 リゾチ -ム液 10 mlに懸濁し、 3 7 :で 2時間反応させた。 反応液に 5 M N a C 2, 4 ml, 0.5 M E D T A ( p H 8.5 ) 0.6 ml, 4 %ラウ リル硫酸 ナ ト リ ウムと 0.7 M N a C £からなる溶液 4.4 mlを順次添加し、 緩やかに混和してから氷水中に 1 5時間置いた。
    [0269] 溶菌物全体を遠心管に移し 4でで 6 0分間 69,400 x gの遠心分 離にかけ上澄液を回収した。 これに重量百分率 1 0 %相当のポリェ チレングリ コ -ル （ p E G ) 6, 0 0 0 (半井化学薬品社製） を加え、 静かに混和して溶解後， 氷水中に置いた。 1 0時間後 1, 5 0 0 X g で 1 0分間遠心分離してペレッ トを回収した。 T E S緩衝液 5 mlを 加えてぺレッ トを静かに再溶.解してから 1.5 mg/mlェチジゥムブロ マイ ド 2.0 mlを添加し、 これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し 密度を 1.5 8 0に合わせた。 この溶液を 105，000 x g， 18でで 4 8 時間超遠心分離にかけた。 この密度勾配遠心により共有結合で閉じ られた環状の υ Ν Αは紫外線照射することによって遠心チュ―ブ中 下方の密度の高いバンドとして見出された。 このバンドを注射器で 遠心チュ―ブの側面から抜きとることによって p C E 5 2 D N Aが
    [0270] Ο ΡΙ 分離された。 次いで分画液を等容量のィ ソプロ ピルアルコ -ル液 〔容量百分率 9 0 %ィ ソプロ ピルアルコ -ル， 1 0 % T E S緩衝液 ( この混液中に飽和溶解量の塩化セ シウムを含む） 〕 で 5回処理し てェチジゥムブ口マイ ドを抽出除去し、 しかる後に T E S緩衝液に 対して透析した。
    [0271] 上記と同様に ト リプト ファ ン生産性のコ リネバクテ リ ゥム · グル タ ミ ク ム L A R - 1株 （ F E R M P - 6 9 0 8 , F E R M B P - 4 5 1 ) を p T r p 4 - 3で形質転換した。 得られた形質転換株 は米国ァメ リ カ ン * タ イ プ ' カルチ ャ ー ' コ レク シ ョ ンに Coryne— bacterium glutamicumK 3 1 , A T C C 3 9 2 8 0 として寄託され ている。
    [0272] p T r p 2 - 3保有株コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K 2.0 , 丁（： 3 9 0.3 5ぉょび 丁 4 - 3保有株同 K 3 1 A T C C 3 9 2 8 0 による L - ト リプト フ ァ ン生産試験を下記のとおり行つ 菌株を N B液体培地中で 3 0 °C ， 1 6時間振盪培養した菌液 0. 5 mlを 5 mlの生産培地 P 4 〔廃糖蜜 1 0 0 g / ， （ N H.4) 2 S 〇 4 2 Q g / £ , K H 2 P 04 Q. 5 g / £ , K 2 H P 0 4 0. 5 g / & , M g S 04 · 7 H 2 0 0. 2 5 g / , C a C 03 2 0 g / i , p H 7. 2 , 以下同じ〕 の入った試験管に植菌し、 3 0でで 9 6時間振盪培養した。 培養後、 培養濾液をべ -パ-クロマ トグラ フ ィ -にかけ、 ニ ン ヒ ド リ ン発色後、 比色定量して、 L - ト リプト フ ァ ンの生成量を測定した。
    [0273] 対照として、 L A - 1 0 5株ぉょび1 4 1¾ - 1株を同様に処理し し o
    [0274] 結果を第 4表に示す。
    [0275] CMFI
    [0276] . vIPO ^ 4 珠 L— ト リプト フ ァ ン （mg/ral)
    [0277] L A - 1 0 5
    [0278] LA-105/ΡΤΓΡ 2-3 ( K20, ATCC39035 ) 0.3 4
    [0279] L A R - 1 0.4 8
    [0280] LAR-1 /ΡΤΓΡ 4-3 ( 3L ATCC39280 ) 1.1 2 実施例 4
    [0281] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2のア ンスラ ニル酸合成酵素遺伝子のコ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クムでのクロ 一 ン化と ト リ トラァ ンの生産 ：
    [0282] (1) 染色体 D N Aの調製法 ：
    [0283] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2の染色体 D N Aを以下の方法で調製した。 ' ブレビバクテ リ ゥム · フラブム A T C C 1 4 0 6 7に替えて、 コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2を用いる以外 は実施例 3 (1)と同様に行って、 染色体 D N Aを調製した。
    [0284] (2) アンスラニル酸合成酵素遺伝子のク口 -ン化 ：
    [0285] 実施例 3 (4)で調製した p C E 5 2プラス ミ ド D N A 3 gおよび 上記で調製した染色体 D N A 9 gを用いる以外は実施例 3 (2)と同 様に行ってリガ-ゼ反応混合物を得た。 ―
    [0286] (3) 組換え体プラス ミ ドの形質転換 ：
    [0287] 上記で得られたリガ-ゼ反応混合物を用い、 実施例 3 (3)と同様に 行って形質転換株を得た。
    [0288] これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス ミ ド D N Aを単離した。 形質転換株の一株から得られたプラス ミ ド p T r p 9 - 1を各種制限酵素消化後ァガロ -スゲル電気泳動で解析した結
    [0289] R£A 果、 p C E 5 2の唯一の S a i l切断部位に約 7. 3 K bの S a 1 I D A切断片が挿入されたプラス ミ ドであることがわかった。
    [0290] p T r p 9 - 1を用い、 同様な方法で L A 1 0 5株を再形質転換 したところ、 ト リプトフ ァ ン 1 0 0 g / mlおよび力ナマイ シン 400 μ g /1111を含む1？ C G P寒天培地上で生育するコロニ -は、 同時に ア ンスラ二ル酸非要求性となり、 それらは、 S a 1 I の切断様式で 判定される p T r p 9 - 1 と同一のブラス ミ ドを保有していた。
    [0291] 以上の結果は、 クロ - ン化された約 7. 3 K bの S a 1 I D N A切 断片にはコ リネバクテ リ ゥム ， グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2の アンス ラニル酸合成酵素をコ - ドする遺伝子が存在し、 それがコ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム L A 1 0 5株中で発現していること を示す。
    [0292] (4) p T r p 9 - 1保有株からの ト リブト フ ア ンアナ口グ耐性ブラス ミ ド p T r p i 3 — 2の取得 ： * " p T r p 9 - 1を保有する L A - L 0 5株を、 カナマイ シン 1 0 μ g / mlを含む N B培地で対数増殖の後期まで増殖させた。 菌体を 5 0 m M ト リス · マレイ ン酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) で 2回遠心洗浄後、 N — メ チルー N ' 一二 ト ロ — N — ニ ト ロ ソ グァ二ジン 4 0 0 M g / mlを舍む 5 0 m M ト リス * マレイ ン酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) 中で、 室 温で 3 0分間処理した。 処理菌体を 5 0 mMト リス · マレイ ン酸緩衝 液 （ P H 6. 0 ) で 2回遠心洗浄後、 洗浄菌体をカナマイ シ ン 1 0 g /mlを含む N B培地中、 3 0 tで 1 6時間培養し、 実施例 3 と同様 の方法でプラス ミ ド D N Aを単離した。
    [0293] 単離したプラス ミ ドを用い、 L A - 1 0 5株を実施例 3 と同様の 方法で形質転換した。 形質転換株の選択は、 4 -メ チルト リプトフ ア ン 0. 5 mg / mlあるいは 6 — フルォロ ト リプト フ ア ン 0. 5 rag/mlを 客々単独、 あるいはカナマイ シン 2 0 / mlを同時に含む RCGP 寒天培地上で行った。 出現したコロニーから、 各々对応する ト リプトフアンアナログ 0.5 rag /mlを含む M 1寒天培地およびカナマイシン 1 0 g /mlを 含む N B寒天培地上で生育できるコロニーを選択した。
    [0294] このようにして得た形質転換株は、 ト リブトファン非感受性のァ ンスラニ^;'酸合成酵素をコードする遺伝子を持つプラス ミ ドを有し ていた。 このようなプラス ミ ドの一つ p T r pl3— 2がコー ドする アンス ラニル酸合成酵素の 5 0 %阻害ト リプト フ ァ ン濃度は 0.25 m Mで、 p T r p 9 - 1のコードするアンスラニル酸合成藓素の 50 %阻害ト リプト ファン濃度 0.0 0 6 m Mと比較して約 40倍ト リプ ト ファン菲感受性であった。
    [0295] 実施例 3と同様にしてコ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム L A R - 1を p T r p 1 3— 2で形質転換した。 得られた形質転換株は米 国ァメ リカ ン - タイプ · カルチャー · コ レク ショ ンに Corynebacteriura glutamicura 37, ATCC39285として寄託されている。
    [0296] (5) 形質転換株による ト リプトファ ンの生産：
    [0297] P T r p 1 3 - 2保有株コ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム K37, ATCC 39285 による L - ト リプトファ ン生産試験を下記のとおり行 っ プ o
    [0298] 菌株を M B液体培地中で 3 0で， 1 6時間振盪培養した菌液 0.5 mlを 5 mlの生産培地 P の入った試験管に植菌し、 3 0でで 9 6時 間振盪培養した。 培養後、 培養瀘液をペーパーク口マ トグラフィ ー にかけ、 ニンヒ ド ン発色後、 比色定量して、 L— ト リブトフ ァ ン の生成量を測定した。
    [0299] 对照として、 L A R - 1铢と L A R— 1 / p T r p 9 - 1株を同 様に処理した。 L A R— l / p T r p 9— 1は、 p T r p 9 — 1で L A R - 1株を形質転換して上記と同様に作製した。
    [0300] 結果を第 5表に示す。
    [0301] OMPI 株 L - ト リ プ ト フ ア ン （mg/tnl)
    [0302] L A - 1 0.4
    [0303] L A R - l / p T r p 9 - l 0.7
    [0304] L A R - l / p T r p l 3 - 2 1.2 実施例 5.
    [0305] コ リネバクテ リ ゥ厶 ♦ グルタ ミ ク厶 K 3 8のコ リス ミ ン酸ミ ユタ一 ゼおよびプレフヱ ン酸デヒ ドラターゼ遺伝子のコ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クムでのク ローン化とフヱニルァラニンの生産 ：
    [0306] (1) 染色体 D Ν Αとプラス ミ ド p C G 1 1の調製法 ：
    [0307] コ リ ネバクテ リ ウム ♦ グルタ ミ クム K 3 8 , F E R M P— 7087 の染色体 P N Aを以下の方法で調製した。 ， . '
    [0308] 4 0 0 ml半合成培地 S S Mに種培養を接種して 3 0 :で振盪培養 した。 種培養は N B培地を用いた。 東京光電比色計で 6 6 0 n mに おける吸光度 （ 0 D ) を測定し、 ◦ D 0.2になった時点で培養液中 0.5単位/ mlの濃度となるようにぺニシ リ ン Gを添加した。 さ らに 培養を継続し 0 D約 0.6になるまで生育させた。
    [0309] 培養液から菌体を集菌し、 T E S緩衝液で洗浄後、 リゾチーム液 ( 2 5 % シ ョ糖， 0.1 M N a C ^， 0.0 5 M ト リ ス ， 0.8mg/ mlリゾチーム ： p H 8.0以下同じ） で 1 0 mlに懸濁し 3 7でで 4時 間反応させた。 集菌した菌体から斎藤らの方法に従って高分子染色 体 D N Aを単離した。
    [0310] べクタ一として用いる p C G 1 1は実施例 1の方法で単離した。
    [0311] (2) パラ フルオロ フヱ二ルァラニン （ P P ) 耐性形質を支配する遺 伝子のク ローン化 ：
    [0312] 上記で調製した P C G 1 1プラス ミ ド D N A 3 /i gを含む制限酵 素 B g ^ H反応液 £に 5単位の B g ^ Πを、 また染色体 D N " A 9 gを含む制限酵素 B a m H I反応液 〔10m M ト リ ス， 7 m M M g C £ 2 ， 100 m M N a C , 2 m Mメ ルカプト エタノ ール P ◦.0 1 %ゥシ血清アルブミ ン， p H 8.0 (以下同じ） 〕 1 0 0 ^ に 5単位の B a m H Iを加え， それぞれ 3 7でで 6 0分間反応後 65 でで 1 0分間加温して反応を停止させた。 雨反応液を混合後、 この 混合物に T 4 リガーゼ用緩衝液 II 40 y« H , A T P ( 5 m M ) 40 i 、 T 4 リガーゼ 0.4 ^および H20 1 2 0 ^を加え， 1 2でで 1 6時間反応させた。
    [0313] (3) 組換えプラス ミ ドの形質転換：
    [0314] このリガーゼ反応混合物を形質転換に供した。 形質転換に供する 受容菌として、 コ リネバクテリ ウ厶 · グルタ ミ クム L - 1 5 A T C C 3 1 8 3 4を用いた。 L - 1 5株の種培養を N B培地に植菌し 3 0 'で振盪培養し^。 0 D 0.6になった 点で集菌し、 該細胞 を R C G P培地に 1 rag /mlのリゾチームを含む液 （ p H 7.6 ) に約 1 09 細胞/ mlとなるように懸濁し、 L型試験管に移して 3 0 で 5時間緩やかに振盪反応してプロ トプラス ト化した。
    [0315] このプロ トプラス ト懸濁液 0.5 mlを小試験管にとり 2.5 0 0 x g で 5分間遠 分離し、 T S M C緩衝液 1 mlに再懸蜀して遠心洗浄後、 T S M C緩衝液 0. 1 mlに再懸濁した。 この懸濁液に 2倍濃度の T S M C緩衝液と上記リガーゼ反応 D N A混合物の 1対 1混合液 100 i を加えて混和し、 次いで T S M C緩衝液中に 2 0 % P E G 6, 0 0 0 を含む液 0.8 mlを添加して混合した。 3分後、 R C G P培地 （ p H 7.2 ) 2 mlを添加し、 2.5 0 0 X gで 5分間遠心分離にかけて上澄 み液を除去し、 沈降したプロ トプラス トを 1 mlの R C G P培地に懸 濁してから 0.2 mlをズぺクチノマイ シン 2 0 0 g / mlを含む R C G P寒天培地に塗抹し、 3 0でで 7 日間培養した。
    [0316] 選択プレー ト上に生育したスぺクチノ マイ シン耐性コロニーをか
    [0317] O PI き集め、 生理食塩水を用いて 2回遠心洗浄後、 スぺクチノ マイ シン 1 0 0 μ g /mlおよび P F P 0. 5 nig / mlを含む最小寒天培地 M 1 に 塗布して 3 0 で 2 日間培養し、 スぺクチノ マイ シン耐性でかつパ ラフルオロフェニルァラニン耐性となった形質転換株を選択した。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス ミ ド D N Aを単離した。 形質転換株の一株から得られたプラス ミ ド p C S - C M 1を各種制限酵素消化後ァガロースゲル電気泳動で解析した結 ' 果、 p C G 1 1の唯一の B g i Π切断部位に約 9. 4 K bの B amH I D N A切断片が挿入されたプラス ミ ドであることがわかった。
    [0318] 次に、 コ リ スメ ― ト厶タ —ゼ， プレフヱネ - トデヒ ドラタ ―ゼを 欠損したコ リ ネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クムのフヱニルァラニン， チロシン要求株を受容菌として前記と同様に形質転換を行い、 スぺ クチノ マイ シン耐性でかつ、 フ ヱニルァラ ニン， チロシン非要求性 ' となった形質転換株を選択した。
    [0319] これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス ミ ド D N A を単離した。 形質転換株の 1株から得られたプラス ミ ド p C S - C M 2を各種制限酵素消化後ァガロ -スゲル電気泳動で解析した結果、 P C G 1 1の唯一の B g & Ιί切断部位に約 9. 4 K bの B a m H I D A切断片が挿入されたブラス ミ ドであることがわかった。
    [0320] 以上の様にして得られた p C S — C M 1 ， p C S — C M 2は、 下 記の E c o R I ， S a £ I , H i n d ΠΙなどの各種制限酵素の切断 パターンから、 同一のプラス ミ ドであることが判明した。
    [0321] BamH I Hindn Bco I Sal I BamH I
    [0322]
    [0323] R£A1T
    [0324] OMPI p C S - C 1 , p C S - C M 2を用い、 同様な方法でコ リネバ クテ リ ゥム · グルタ ミ クムのフエ二ルァラニン， チロシン要求珠を 形質転換したところ、 フヱニルァラニン， チロシンを各々 1 0 0 μ g / mlおよびスぺクチノマイ シン 2 0 0 ju g / mlを含む R C G P 寒天培地上で生育するコロニーは、 同時にフエ二ルァラニン， チロ シン穽要求性かつ、 P F P耐性となり、 それらは各々 p C S - CM1, P C S - C M 2と同一のプラス ミ ドを保有していた。
    [0325] 以上の結果は、 P C S— C M 1 , p C S - C M 2にクローン化さ れた約 9.4 K bの BatnHI D N A切断片には、 コ リネバクテリ ウム • グルタ ミ クム K 3 8のコ リスメ ー ト厶ターゼ， プレフヱネー トデ ヒ ドラターゼ遺伝子が存在し、 さらにこの D N A断片によって、 コ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クムにノ、。ラフルオロフェニルァラニン 耐性が付与され ことを示している。
    [0326] (4) 形質転換株に'よるフエ二ルァラ ンの生産：
    [0327] 上記と同様にして、 フヱニルァラ二ン生産性のコ リネバクテリ ゥ. ム · グルタ ミ クム K 3 8株 （ F E R M P - 7 0 8 7 , F E R B P - 4 5 4 ) を p C S - C M 2で形質転換した。 得られた形質転 換株は、 微ェ研に Corynebacterium glutamicutn 39, F E R M P - 7 0 8 8 ( F E R M B P— 4 5 9 ) として寄託されている。
    [0328] P C S - C 2保有株， コ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム K 3 9 による. L -フヱニルァラ二ンの生産試験を下記のとおり行った。 菌株を N B液体培地中で 3 0 ：， 1 6時間振盪培養した菌液 0.5 mlを 5 mlの生産培地 P 4の入った試験管に植菌し、 3 0 tで 9 6時 間振盪培養した。 培養後、 培養濾液をペーパーク口マ トグラフィ ー にかけ、 ニンヒ ド リ ン発色後、 比色定量して、 L -フヱニルァラ二 ンの生成量を測定した。
    [0329] 对照として、 コ リネバクテリ ウム · グルタ ミ-クム K 3 8株を同様 に処理した。
    [0330] 一 OMPI 結果を-第 6表に示す。
    [0331] 6
    [0332] L - フヱ二ルァラニン 株 ( rag / m 1 ) コ リネバクテ リ ゥム • グルタ ミ ク厶 K 3 8 6.0
    [0333] コ リネバクテ リ ゥム • ク レタ ミ クム K 3 9 9.6 実施例 6.
    [0334] (1) 大腸菌ス レオニン · オペ口ン舍有 D N A断片のクローン化 ：
    [0335] クローン化は大腸菌の宿主べクタ一系にて実施した。 ベクターと して使用した P G A22は本プラス ミ ドを作製したアンらの方法 〔Απ， G. et al ： J. Bacteriol. , 140， 400 ( 1 9 7 9 ) ] に従い、 本 プラス ミ ドを保有する大腸菌 Κ一 1 2株亜株の培養菌体から単離し 1ζ0 供与体 D Ν Αとなる染色体 D N Aは大腸菌 K - 1 2株 H f r株 ( ATCC23740)の培養菌体から、 ス ミ スのフ ノ ール抽出法 〔Smith， . G. ： Methods, in Bnzymology, 12, partA, 5 4 5 (1967) 〕 こ 従って単離した。
    [0336] P G A 2 2プラス ミ ド D N A 4 gを含む制限酵素 H i n d m反 応液 （ 1 0 m M ト リス ， 7 m M M g C £ 2 , 60m M N a C , P H 7.5, 以下同じ） 6 0 ^に 0.4単位の H i n d IE ( 1 6単位 / " ·Τ) を添加し、 3 7でで 3 0分間反応後、 6 5でで 1 0分間加 温して反応を停止した。 p G A 2 2には 2個所の H i n d m切断部 位があるが、 同一条件で H i n d IE消化した試料をァガロースゲル 電気泳動で調べた結果、 一断片に切断されていることが確認された。 別に染色体 D N A 8 ί gを含む制限酵素 H i n d EI反応液 140 & に 4単位の H i n d mを添加し、 3 7 で 6 0分間反応後、 6 5 で 1 0分間加温して反応を停止させた。 両反応消化物を混合し、 T 4 リガーゼ緩衝液 Π 40^ ^ , Α Τ Ρ ( 5 ΓΠ ) 4 0 ^ ^ , Τ 4
    [0337] Ο ΡΙ リガーゼ β £および H20 1 2 Q μ &を加え、 1 2 :で 1 6時間 反応させた。 この反応混合物を T E S緩衝液で飽和したフ エノ ール 4 0 0 ； " ^で 2回抽出し、 T E S緩衝液に对して透析してフ エノ ー ルを除去した。 - この リ ガーゼ反応混合物を大腸菌 K - 12株亜株 G T - 3 〔J. Bac- teriol. , 1 1 7 , 1 3 3 ( 1 9 7 4 ) 〕 ( 3種類のァスバルトキ ナーゼを欠損した変異株， ホモセ リ ンおよびジアミ ノ ピメ リ ン酸要 求性） の形質転換に供した。 G T - 3のコ ンビテ ン トセルはダジヱ ル ト らの方法 〔Dagert， M. et a^. ： Gene 23 (1979) 〕 で調製 した。 即ち、 100 g / mlとなるようにジァミ ノ ピメ リ ン酸を補つ た L培地 （バク ト ト リべ ト ン 1 0 g ， 酵母エキス 5 g， ブドウ糖 1 gおよび塩化ナ ト リ ウム 5 gを水 1 に含み、 p H 7. 2に調整した 培地） 5 O nii G T - 3株を植菌し、 東京光電比色計で 6 6 .0 n m における吸光度 （ 0 D ) が 0.5 になるまで 3 7 で培養した。 培養 液を氷水中で 1 0分間冷却してから遠心集菌した。 菌体を冷却した 0. 1 M塩化カルシウム 2 0 mlに再懸蜀し、 0でに 2 分間置いた。 菌体を再遠心し、 0. 1 M塩化カルシウム 0. 5 mlに懸蜀し、 0でで 1 8時間置いた。 塩化カルシウ ム処理した菌液 4 0 0 ^ ^に前記リ ガーゼ反応混合物 2 0 0 / を添加混合し、 0でに 1 0分間置いて から 3 7でで 5分間加温した。 次いで L培地 9 mlを添加し、 3 7で で 2時間振盪培養した。
    [0338] 生理食塩水で 2回遠心洗浄後、 1 2. 5 g /ml相当のカナマイ シ ンを添加した M 9最小寒天培地 （ブドウ糖 2 g、 N H 2 C ^ l g、 N a 2 H P 04 6 g、 K H 2 P 04 3 g、 M g S 04 ♦ 7 H 2 〇 0. 1 g、 C a C £ 2 ♦ 2 H 2 0 1 5 mg、 サイアミ ィ塩酸塩 4 ragお よび寒天 1 5 gを水 1 に含み、 p H7.2 に調整した培地、 以下同 じ） に塗布し、 3 7 で 3 曰培養した。 出現した、 ただ 1つのコロ ニーは P G A 2 2の選択マーカ一である薬剤ァンピシ リ ン 2 5 « g /ml、 ク ロ ラムフヱニコール 2 5 ^ g /mlあるいはカナマイ シン 25 g /mlを含む寒天培地上でも生育することが確認された。
    [0339] この形質転換株の培養菌体から前記の P G A 2 2を単離したのと 同一の方法によりプラス ミ ド D N Aを単離した。 このプラス ミ ド D Aを制限酵素消化とァガロースゲル電気泳動で解析した結果、 第 1図に P G H 2 として示した構造を有していた。 p G A 2 2に挿入 された N A断片は、 既にクローン化された大腸菌オペ口 ン含有 D N A断片 〔Cossart, P. et al ： Molec. Gen, Genet. , 175 ， 39
    [0340] ( 1979) 参照〕 と同一の制限酵素切断部位を有していることから p G H 2がス レオニンオペ口 ンを舍有することが確認された。
    [0341] (2) p C G l l と p G H 2の試験管内組換え
    [0342] 実施例 1 と同様にして得た p C G l 1 プラス ミ ド D N A 2 // gを 含む制限酵素 B g 2 Π反応緩衝液 1 0 0 ^に 2単位の B g ^ Π ( 6単位/ ) を添加し， 37でで ·6 0分間反 させた。 別に p G Η 2プラス ミ ド D N A 2 gを含む制限酵素 BamH I反応緩衝液 100 « ^に 2単位の BamH I ( 6単位/；" ^ ) を添加し， 3 7 :で 6 0分 間反応させた。 両消化物を 6 5 でで 1 0分間加温した後、 混合し、 T 4 リガーゼ緩衝液 II 40 、 A T P ( 5 m M ) 4 0 〃 ^、 T 4 リガーゼ 0. 2 M £および H20 120 iを加え、 1 2でで 1 &時間反 応させた。 この混合物を T E S緩衝液で飽和したフエノ ール 4 0 0 /■gで 2回抽出し、 T E S緩衝液に対して透析してフエノ ールを l¾kふしん。
    [0343] (3) p E t h r 1の取得
    [0344] 形質転換はコ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム L A 2 0 1株 （ホ モセ リ ン ♦ 口イ シン要求株） のプロ トプラス トを用いて行った。 コ リネバクテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム L A 2 0 1株の種培養を N B培地 に植菌し、 3 0 :で振盪培養した。 0 D 0. 6になった時-点で集菌し、 該細胞を R C G P培地に 1 rag /mlのリゾチームを含む液 （ p H 7. 6 ) に約 103細胞/ mlとなるように懸濁し、 L型試験管に移して 3 0で で 5時間穏やかに振盪反応してプロ トプラス ト化した。
    [0345] このプロ トプラス ト菌液 0.5mlを小試験管にとり、 2.5 0 0 X g で 5分間遠心分離し、 T S M C緩衝液 1 mlに再懸濁して遠心洗浄後， T S M C緩衝液 0.1 mlに再懸濁した。 この菌液に 2倍濃度の T S C緩衝液と上記リガーゼ反応 D N A混合物の 1対 1混合液 100 £ を加えて混和し、 次いで T S M C緩衝液中に 2 0 % P E G 6, 0 0 0 を含む液 0.8mlを添加して混合した。 3分後、 R CGP培地 （ p H 7.2 ) 2 nilを添加し、 2, 5 0 0 X gで 5分間遠心分離にかけて上澄 み液を除去し、 沈降したプロ トプラス トを 1 mlの R C G P培地に懸 濁してから 3 0でで 2時間穏やかに振盪した。 ついで、 このプロ ト プラス ト懸篛液の 0.1mlをカナマイ シン 40 0 g / mlを含む R C GP寒天培地に塗抹し、 3 0でで 6曰間培養した。
    [0346] 寒天培地上前面に生育したカナマイ シン耐性形質転換株をかき集 め、 生理食塩水で遠心洗浄後、 ロイ シン 5 0 g / mlを補充した最 少寒天培地 M 1上に再塗布して 3 0 で 3日間培養した。 出現した コロニーの中からカナマイ シン 2 0 iig /nilおよびスぺクチノマイ シン LOO i g / mlを含む N B寒天培地上で生育できる株が得られた t 任意に選んだ 3株を 4 0 0 mlN B培地で 0 D約 0.8になるまで生 育させ、 集菌後、 その培養細胞から実施例 1記載のェチジゥムブ口 マィ ドーセシゥ厶クロライ ド密度勾配遠心により、 プラス ミ ドを単 離した。 いずれの株からも 4 0〜 5 5 gのプラス ミ ド D N Aが取 得された。
    [0347] これらのプラス ミ ド D N Aを制限酵素消化とァガロースゲル電気 泳動で解析し、 分子量と制限酵素 P s t I ， E c o R I、 および X h o Iの切断点を同定した。 一株から得られたブラスミ ドを
    [0348] P E t h r 1と命名し、 その構造を第 2図に示した。 p E t h r 1 は P C G 11に p G H 2のスレオニンオペ口ンを舍む B a m H I切断
    [0349] O PI ■ 片を結合した構造を有することが判明した。 残りの 2株中、 1株は p E t h r 1 と同一プラス ミ ドを保有しているが、 他の一株は p E t h r 1 とは p G H 2のス レオニンオペロ ン含有 B a m H I切 断片の結合向きが逆向きに挿入されているプラス ミ ドを保有してい これらのプラス ミ ド D N Aを用いてコ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム L A 2 0 1株を前記と同様に再形質転換した結果、 ホモセ リ ン穽要求性株が高頻度 （再生した生菌あた b約 1 0 "3) で得られ、 それらは全てカナマシィ ンとスぺクチノ マイ シン耐性形質を獲得し ており、 各種制限切断様式で特徵付けられる供与プラス ミ ドと同一 のプラス ミ ドを保有していた。 .
    [0350] (4) p E t h r 1保有株による L -イ ソロイ シンの生産
    [0351] コ リ ネノ クテ リ ゥ厶 · グルタ ミ クム K 4 0とブレビノ クテ リ ウム • フラブ厶 A— T C C 1 4 0 6マのプロ トプラス トを形質転換して p E t h r 1を導入した。 コ リ バクテ ι)ゥム Κ·4 0 ( FERM Ρ - 7160， FBRM BP- 4 5 5 ) およびブレビバタテ リ ゥム · フラブム A T'C C 1 4 0 6 7を N B培地にて 3 0 で 1 6時間振盪培養し、 その種培 養 0.1 mlを 1 0 mlの SSM 培地の入った L字型試験管に接種し、 モノ 一型培養槽にて 3 0 :で振盪培養した。 0 Dが 0.1 5になった時点 で 0.5単位/ mlになるようにぺニシ リ ン Gを添加した。 さ らに培養 を続け、 0 D約 0.6になったところで細胞を集菌し、 R C G P培地 に 1 rag/mlのリゾチームを含む液 （ p H 7.6 ) 2mlに懸蜀し、 L字 型試験管に移して 3 0 °Cで 1 4時間穏やかに振盪してプロ トプラス ト化した。
    [0352] このプロ トプラス ト菌液 1 mlを小試験管にとり 2, 5 0 0 x gで 1 5 分間遠心分離し、 沈澱物を T S C緩衝液 1 mlに再懸濁して遠心 ( 2.5 0 0 X g ) 洗浄後、 T S M C緩衝液の 0.1 mlを加えて再懸濁 した。 これに 2倍濃度の T S M C緩衝液と上記で単離した p E t h r
    [0353] OMPI 1 D N A液の 1対 1混合液 1 0 0 ^を加えて混和し、 実施例 1 と 同様に P E G 6.0 0 0を介した形質転換を行い、 形質発現させた後、 0. lmlをスぺクチノマイ シン 400" g /mlを舍む R C G P寒天培地 に塗抹し、 3 0 で 1 0曰間培養した。 出現したコロニーの中から スぺクチノ マイ シン 1 0 O ^ g / mlおよび力ナマイ シン 2 0 i g / mlを含む N B寒天培地上で生育できる株が得られた。
    [0354] スぺクチノ マイ シンとカナマイ シンとに同時に耐性になつた形質 転換株を 4 0 Oml S S M培地で振盪培養し、 0 Dが 0.1 5になつ たところで 0.5単位/ mlとなるようにぺニシリ ン Gを添加し、 さら に 0 Dが 0.6 5まで培養し、 集菌した菌体から実施例 1の p C G11 の単離法と同様な方法でプラスミ ドを単離した。 これらのプラスミ ドを制限酵素消化とァガロースゲル電気泳動で解析した結果、 各種 制限酵素切断様式で特徵付けられる p E t h r 1と同一の構造を有 するものがあることがわかった。 このような形質転換'株がコ リネバ クテ リ ゥム · ダルタ ミ クム K41 ( F E R M— P 7 1 6 1 , F E R M ' B P - 4 5 6 ) 、 ブレビバクテリウム * フラブム K 4 2 ( F E R - B P 3 5 5 ) である。
    [0355] コ リネパ'クテリ ウ厶 · グルタ ミ クム K 4 0、 ブレビバ'クテ リ ゥム • フラブム A T C C 1 4 0 6 7およびそれらの p E t h r 1保有铢 の L -イ ソロイ シン生産試験を行った。 N B培地中で 3 0で、 1 6 時間振盪培養した種培養 0.5mlを生産培地 〔ブドウ糖 1 0 0 g、 ( N H 4)2 S 04 2 0 g , K Η 2 Ρ 04 0.5 g , Κ 2 Η Ρ 04 0.5 g , M g S 04 · 7 Η2 0 l g， F e S 04 * 7 H2 0 1 0 rag, Μ η S 04 ♦ 4〜6 Η2 0 1 0 rag， ビォチン 1 0 0 ju g， 炭酸力ルシゥム 3 0 gを水 1 iに含み、 p H 7.2に調整した培地〕 の入った試験管に接種し、 3 0 で 7 2時間振盪培養した。 培養後、 培養濾液をぺ -パ—クロマ トグラフィ —にかけ、 ニンヒ ド リ ン発色 後、 比色定量して L -イソロイシン生成量を測定した。 結果を第 Ί 表に示す,
    [0356] 7 乙一イ ソロイ シン 株 mg / m 1 ) コ リ ネバクテ リ ゥム グルタ ミ クム K 4 0 1.2
    [0357] コ リ ネバクテ リ ゥム グルタ ミ クム K 4 1 2.7
    [0358] ブレビバクテ リ ゥ厶 フラブム A T C C14067 0
    [0359] ブレ ビノ クテ リ ゥム フラブム K 4 2 0.8 実施例 7. チロ シンの製造 ：
    [0360] (1) 染色体 D N Aとプラス ミ ド D N Aの調製 ：
    [0361] 大腸菌 J A 1 9 4株 （Proc. Natl. Acad. Sci., 94, 487-491 (1977)〕 の染色体 D N Aを以下の方法で調製した。
    [0362] 4 0 0 mlの L B ( p H 7.0 , 以下同じ） に種培養を接種して、 37 :で振盪培養し、 射数後期まで生育させた。 培養液から菌体を集菌 し、 集菌した菌体から斎藤らの方法に従って高分子染色体 D N Aを 単離した。
    [0363] ベクタ -として用いる p B R 3 2 2は、 次の方法でその保有株， 大腸菌 J A 1 9 4株の培養菌体から単離した。
    [0364] アンピシ リ ン 1 0 0 g / mlを含む 4 0 0 mlL Bに種培養を接種 し、 37 で振盪培養し、 対数後期まで生育させた。 培養液より集菌 後、 菌体を、 田中らの方法 〔J. Bacteriol. 121_ 354-362 (1975) 〕 に従い溶菌した。 得られた溶菌液を、 28,000 rptn. 4でで 1時間遠 心し、 上清を採取した。 上清に、 1 / 5容の 5 0 % ( W / V ) ポ リ エチレングリ コ -ル （ P E G ) 6, 0 0 0水溶液を加え、 ゆるやかに 混合した後、 4でで一夜放置した。 生じた沈澱を、 4 ， 3.0 0 0 rpra, 5分間の遠心で集め、 5 mlの T E緩衝液 （ 1 0 m M ト 'リ ス， 1 m M E D T A ♦ N a 2 P H 7.5 , 以下同じ） に溶解し、 1.5ΐϋ£_
    [0365] OMPI /ml濃度のェチジゥムブ口マイ ド 1 mlを加え、 さらに T E緩衝液で 正確に 7.5 mlとした。 この溶液に、 C s C ^ 7.8 7 5 gを加え、 完 全に溶解した後、 105, OOOx g , 2 0 t , 4 0時間遠心した。 紫外 線照射下検出されるプラス ミ ドバンドを、 注射器でぬき取り、 1 5 % ( V / V ) の T E緩衝液を舍むィ ソプロパノ -ルで、 ェチジゥム ブロマイ ドを 3回抽出した後、 4 で一夜 T E緩衝液に対して透析 し、 透析液をプラス ミ ド D N Aとして用いた。
    [0366] (2) DAHPase, CMase, PD&aseをコ - ドする遺伝子を含む D N A断片の クロー ンィ匕：
    [0367] 上記で調製した P B R 3 2 2プラス ミ ド D N A 3 gを含む制限 酵素 H i n d E [反応液 1 0 0 / ^に各々 5単位の E c o R Iおよび H i n d mを、 また染色体 D N A 2 gを含む制限酵素 H i n d m 反応液 1 0 0〃 ^に各々 5単位の E c o R I ， H i n d ΙΠを;？ IBえ、 それぞれ 3 7 で' 6 0分間反応後 6.5でで 1 0分間加温して反応を 停止させた。 両反応液を混合後、 この混合物に T 4 リガ-ゼ用緩衝 液 H 40^ ϋ , A T P ( 5 m M ) 0 μ £ , T 4 リガ—ゼ 0.
    [0368] および H 2 O 1 2 Q μ £を加え、 1 2 で 1 6時間反応させた。
    [0369] このリガ-ゼ反応混合物を形質転換に洪した。 形質転換に供する 受容菌として、 D A H P a s eを欠損した大腸菌 A B 3 2 48株
    [0370] [J. Bact. 93 237 -〜 244(1967)〕 あるいは t y r A遺伝子
    [0371] (CMase)を欠損した大腸菌 A T 2273铢 ( J. Bact. 91 1494 ( 1966 ) 〕 を用いた。 種培養液を、. L Bに植菌し、 M.Dagertらの方法 〔Gene， 0_ 2 3〜 2 8 ( 1979 ) 〕 に従って、 コ ンビテン トな細胞を調製し コ ンビテン トな細胞 1 03 /mlを含む液 0.2 mlにリガ -ゼ反応混 合物 5 0 ^を加え、 氷冷下 1 0分間放置した。 次いで 3 7でで 5 分間熱処理した後、 L B 2 mlを加え、 3 7 で 9 0〜 1 2 0分間静 置した。 その後、 菌体を生理食塩水で 2回遠心洗浄後、 各々 50 g
    [0372] O PI / m 1のヒスチジン， プロ リ ン， アルギニ ン， イ ソ ロイ シン， ノ リ ン を含む M 9平板培地 〔 N H 4 C ^ 1 g , N a 2 H P 04 6 g , K H 2 P 04 3 g , N a C ^ 5 g , M g S 04 · 7 H 2 0 0. l g , θ 3 θ £ 2 · 2 Η 2 0 0. 0 1 5 g ， グルコ ース 3 g ビタ ミ ン B , 4 mgを水 1 に含み、 p H 7· 0に調整した培地に寒天 1. 5 %を加えたもの、 J. Bact. 121 354 362 (1975)， 以下同じ〕 に塗布した。 M 9平板培地に生育したコロニ -を各々アン ピシリ ン •1 0 0 g /ml, テ ト ラサイ ク リ ン 2 0 〃 g / mlを含む L B平板培 地に塗布し、 アンピシリ' ン舍有培地で生育し、 テ ト ラサイ ク リ ン含 有培地で生育しないコロニ -を選択した。 このようにして選択した ヒスチジン， プロ リ ン， アルギニン， イ ソロイ シン， ノ リ ンを舍む
    [0373] M 9平板培地で生育し、 アン ピシ リ ン耐性， テ ト ラサイ ク リ ン感受 性の形質転換株より前記と同様にして、 プラス ミ ド D N Aを単離し た。 形質転換株の一株から得たブラス ミ ド p E a r 0 F 1を各種制 限酵素で消化後、 ァガ口 -スゲル電気泳動で解析した結果、 P B R 3 2 2の大きい方の EcoRI-HindHI切靳片に、 約 4. 2 K bの BcoR I - Hindi!切断 D N A断片が揮入されたブラス ミ ドであることが判明 し
    [0374] 得られた P E a r o F 1を用い、 前記と同様の方法で大腸菌 A B 3 2 4 8および大腸菌 A T 2 2 7 3の両株を形質転換したところ、 両者とも ヒスチジ ン ， プロ リ ン， ァノレギニン， イ ソ ロ ンシン ， ノ リ ンを含む M 9培地で生育し、 同時にアン ピシ リ ン耐性となり、 それ らは、 p E a r o F I と同一のプラス ミ ドを有していることが判明 し o
    [0375] 以上の結果は、 p E a r o F I にクロ - ン化された約 4. 2 K bの D N A断片上には、 D A H P a s e , C M a s e , P D G a s eを コ - ドする遺伝子が存在することを示している。
    [0376] さらに、 P E a r 0 F 1 は、 第 3図に示す様な E c o R I
    [0377] ΟΜΡΙ B a m H I , H i n d IEなどの各種制限酵素の切断点を有し、 G. Zurawski らの報告している 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 4271(1978)) プラス ミ ド p K B 4 5 との比較より、 p E a r o F 1 に挿入されている約 4.2 K bの D N A断片上には、 大腸菌の aroF， t r y A , p h e A遺伝子が存在することが判明した。
    [0378] (3) a r o F , t y r A遺伝子のサブクロ— ン化：
    [0379] 上記で調製したプラスミ ド p E a r o F l D N Aより、 a r o F , t r y A遺伝子部分の D N A断片を取得し、 大腸菌， コ リネバクテ リウム · グルタ ミクムの共用べクタ— p C E 5 1に連結した。
    [0380] p C E 5 1は本発明者らが先に特許出願したコ リネバクテリウム • グルタ ミ クムのプラス ミ ド p C G 1 (特開昭 57-134500)と大腸菌 のプラス ミ ド p G A'2 2 n, G. et al： J. Bacterid. ) 140, 400 (1979)参照〕 を和合連結せしめたプラスミ ドである。 詳しくは p C •G 1上に 1力所しかない B g £ Π切断部位と p G A 2 2のカナマイ シン耐性遺伝子を含む B a m H I断片とを両制限酵素の同一接着末 端を利用して連結したものである。
    [0381] 実際には、 本発明者らが先に特許出願した方法 （特開昭 5 8 - 1 0 5 9 9 9 ， 同 5 8 — 1 2 6 7 8 9 ) により作成することができ o
    [0382] プラスミ ド p E a r o F l D N A 3 u gを含む制限酵素 H i n c I反応液 〔 1 0 m M T r i s - H C ^ ( p H 8.0 ) , 7 m M
    [0383] M g C £ 2 , 6 0 m M N -a C :g〕 1 0 0 u £に 5単位の H i n c Eを加え、 3 7で、 6 0分間反応させた。 また、 p C E 5 1を保有 する大腸菌 J A 1 9 4楝より前記と同様にして調製したプラスミ ド P C E 5 1 D N A 3 gを舍む制限酵素 H i n c Π反応液 100〃 i に 0.3単位の H i n c Πを加え、 3 7でで 6 0分間反応させ、
    [0384] P C E 5 1上に 2力所ある H i n c Π切断部位のうち、 1力所のみ で切断した。 反応後、 両反応液を混合後、 この混合物に T 4 リガ -
    [0385] CM I ゼ用緩衝液 Π iOM & , A T P ( 5 m ) 4 0 M i , T 4 リガーゼ 0.4 ^および Η 2 0 I 2 0 β 2を加え、 1 2 :で 1 6時間反 応させた。 反応後、 6 5 で 1 0分間加温して反応を停止させた。
    [0386] このリガ-ゼ反応混合物を形質転換に供した。 形質転換に供する 受容菌として、 大腸菌 A B 3 2 4 8株を用いた。 前記と同様にして 形質転換を行い、 ヒスチジン， プロ リ ン， アルギニン， イ ソ 口イ シ ン， バリ ンを含む M 9平板培地で生育するコロニ -を得た。 得られ たコロニ -から、 カナマイ シ ン 2 0 μ g / mlを含有する L B平板培 地で生育するコロニ -を選択した。
    [0387] このようにして得た、 ヒスチジン， プロ リ ン， アルギニン， イ ソ ロイ シ ン， バリ ンを舍む M 9平板培地で生育し、 カナマイ シ ン耐性 の形質転換株より、 前記と同様に、 プラ ス ミ ド D N Aを単離した。 形質転換株の.1株から得られたプラス ミ ド p K m l a r o F lを各 種制] ¾酵素で消化 、 了ガ。 -スゲル電気泳動で解析した結果、 p C E 5 1の一方の H i n c Π切断部位に、 約 3.8 K bの pEaroFl の a r 0 F . t y r Aを含む H i n c Π切断 D N A断片が挿入され たブラス ミ ドであることが判明した。
    [0388] 以上の様にして得られたプラス ミ ド p K m 1 a r 0 F 1 は、 第 4 図の様な各種制限酵素の切断パタ - ンを有する。
    [0389] (4) p K m 1 a r o F 1保有株からのチロ シンおよびチロ シンアナ 口 グ耐性プラス ミ ド p K m l a r o F l — m — 1 8の取得 ：
    [0390] p K m 1 a r o F 1を保有する A B 3 2 4 8株を、 カナマイ シ ン 2 0 8 / nilを含む L B培地で対数増殖の後期まで増殖させた。 菌 体を 5 0 m M ト リス * マレイ ン酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) で 2回遠心洗 浄後、 N -メ チル - N ' —ニ ト ロ — N —ニ トロソグァ二ジン 4 0 0 β g /mlを舍む 5 0 m M ト リス * マレイ ン酸緩衝液 （ p H 6.0 ) 中 で、 室温で 3 0分間処理した。 処理菌体を 50 m M ト リス · マ レイ ン 酸緩衝液 （ p H 6.0 ) で 2回遠心洗浄後、 洗浄菌体をカナマイ シン 2 0 μ g / mlを含む L B培地中、 3 0 t:で 1 6時間培養し、 前記と 同様の方法でプラス ミ ド D N Aを単離した。
    [0391] 単離したプラス ミ ドを用い、 大腸菌 A B 3 2 4 8株を前記と同様 の方法で形質転換した。 形質転換株の選択は、 チ口シン 0. 2 5 mg/ ml、 各々 5 0 g / mlのヒスチジン， プロ リ ン， アルギニン， イ ソ ロイ シン ， バリ ンを含む M 9平板培地上で行った。 出現したコロニ —から、 チロ シンの 0. 2 5 mg / ml， ヒスチジン， プロ リ ン， アルギ ニン， イ ソロイ シン， バリ ン各々 5 0 gダ mlを含む M 9平板培地 およびカナマイ シン 2 / mlを含む L B平板培地上で生育でき るコロニ -を選択した。
    [0392] このようにして得られたコロニ -は、 また同時にチロシンアナ口 グである 3 — Tミ ノ チロシン （ 3 A T ) ( Sigma 社製） 0. 2 mg/ml およびヒスチジン， プロ リ ン， アルギ ン， イ ソ ロ イ シン， ノヽ'リ ン - 各々 50 g'/mlを含む M 9平板培地上で生育でき、 3 A T耐性であ ることが判明した。 ' このようにして得た形質転換株から得たプラス ミ ドは、 細菌にチ 口シンまたはチロシンアナ口グ耐性を与えることができる。 このよ うなプラス ミ ドの 1つ p K m l a r o F - m - 1 8を有する大腸菌 A B 3 2 4 8株は、 チロシン 1 mg / mlあるいは 3 A T 0. 5 rag / mlと、 5 0 « g / mlのヒスチジン， プロ リ ン， アルギニン， イ ソ ロ イ シン， バリ ンを舍む M 9平板培地で生育が可能である。
    [0393] (5) p K m l a r o F l , p K m l a r o F l — m — 1 8によるコ リ ネバクテ リ ゥ 厶 · グルタ ミ ク ム K 4 3 の形質転換 ：
    [0394] 5 0 i g /mlのフ エ二ルァラニンを含む半合成培地 S S Mにコ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ ミ ク ム K 4 3 ( F E R M P - 7 1 6 2 , F E R M B P - 4 5 7 ) 種培養を接種して 3 0 でで振盪培養した。 種培養は N B培地を用いた。 東京光電比色計で 6 6 0 n mにおける 吸光度 （◦ D ) を測定し、 ◦ D 0. 2になった時点で培養液中 0. 5単
    [0395] OMPI IPO 位 /mlの濃度となるようにべニシ リ ン Gを添加した。 さらに培養を 继続し 0 D約 0.6になるまで生育させた'。
    [0396] 0 D 0. 6になった時点で集菌し、 細胞を R C G F培地に 1 mg/ml のリゾチームを含む液 （ p H 7. 6 ) に約 1 0 3 細胞/ mlとなるよう に懸濁し、 L型試験管に移して 3 0 でで 5時間緩やかに振盪反応し てプロ ト プラス トィヒした。 このプロ ト プラ ス ト懸濁液 0. 5 mlを小試 験管にとり 2, 5 0 0 x gで 5分間遠心分離し、 T S M C緩衝液 1 ml に再懸濁して遠心洗浄後、 T S M C緩衝液 0. 1 mlに再懸濁した。 こ の懸濁液に 2倍濃度の T S M C緩衝液と上記プラ ス ミ ド D N Aの 1 対 1混合液 1 0 0 ·βを加えて混和し、 次いで T S M C緩衝液中 に 2 0 % P E G 6. 0 0 0を含む液 0. 8 mlを添加して混合した。 ブラ ス ミ ド D N A p K m l a r o F l ， p K m l a r o F l - m - 1 8 は、 これらを保有する大腸菌 A B 3 2 4 8株より上述の如く調製し た。 3分後、 ' R C G P培地 （ p H 7. 2 ) 2 mlを添'加し、 2: 5 0 0 x gで 5分間遠心分離にかけて上清を賒去し、 沈降したプロ トプラ ス トを l mlの R C G P培地に懸'蜀してから 0. 2 mlをカナマイ シン 2 0 0 μ g / mlを含む R C G P寒天培地に塗布し、 30°Cで 7 日間培養した。 このようにして、 選択プレー ト上に生育したカナマイ シン耐性コ口 ニーを得た。
    [0397] (6) 形質転換株によるチロシンの生産 ：
    [0398] 上記のようにして得られた p K m 1 a r o F 1 ， p K m 1 a r o F 1 - m - 1 8を保有する形質転換株は、 微ェ研に Corynebacterium glutamicum K 4 4 , F Ε Μ Ρ - 7163 ( F Ε R Β Ρ - 4 5 8 ) ' および Corynebacterium glutamicum Κ 4 5 , F Ε R Ρ - 7164 ( F E R M Β Ρ - 4 6 0 ) としてそれぞれ寄託されている。
    [0399] p K m 1 a r o F 1 , p K m l a r o F l - m - 1 8保有株 よ る L -チロシン生産試験を下記のとおり行った。
    [0400] 菌株を N B液体培地中で 3 0 ， 1 6時間振盪培養した菌液 0. 5 mlを 5 mlの生産培地 P 4に 0. 2 5 % N Zアミ ンを添加した培地の入 つた試験管に植菌し、 3 0 で 9 6時藺振盪培養した。
    [0401] 培養後、 培養液 1 mlに 6 N N a 0 H溶液を 5 0 ·2加え、 6 5 でで 5分間加熱し、 析出しているチロシンを完全に溶解させた後、 培養濾液をペーパークマ トグラフィ一にかけ、 ニンヒ ドリ ン発色後， 比色定量して、 L -チロシンの生成量を測定した。
    [0402] 対照として、 コ リネパクテリ ゥム - グルタ ミ クム Κ 4 3株を同様 に処理した。
    [0403] 結果を第 8表に示す。
    [0404] 第 8 表
    [0405] Lーチロシン 铢 ( rag / ml ) コ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム K 4 3 4.8
    [0406] 〃 Κ 4 4 5. 3
    [0407] Κ 4 5 7. 7
    [0408] 実施例 8 . アルギニンの製造 ：
    [0409] (1) P L C 2 0 - 1 0 と P C E 5 4の試験管内組換え ：
    [0410] p L C 2 0 - 1 0はそれを保有する大腸菌 Κ - 1 2株亜株の培養 菌体からアンらの方法 〔An， G. et al. ： J. Bacteriol. , 1 4 0 ，
    [0411] 4 0 0 ( 1979) 〕 に従い単離した。 p C Ε 5 3は実施例 3の方法で 単離した。
    [0412] P L C 2 0 — 1 0プラス ミ ド D N A 5 i gを含む制限酵素 P s t I · B a m H I用反応緩衝液 〔 1 5 m M ト リ ス， 10 m M M g C £ 2 ,
    [0413] 5 0 m M N a C £ ， 2 5 m M ( N H 4) 2 S 04， l m Mメ ルカプト エタノ ール， 0· 0 1 %ゥシ血清アルブミ ン， ρ Η 8. 0〕 3 0 £に 5単位の P s t l ( 5単位/ ; と 5単位の B a m H I ( 5単位
    [0414] OMFI / ^•g ) を添加し、 3 3 :で 90分間反応させた。 p C E 5 3プラス ド D N A 5 " gについても同じ反応を行った。 両消化物を 6 5 でで 1 0分間加温した後混合し、 T 4 リガーゼ緩衝液 ]! I ^ μ i-, A T P ( 4 0 m M ) μ i , T 4 リガーゼ 0.3 ； " ^および H 2 0 3 0 ω ·δを加え、 4でで 1 2時間反応させた。
    [0415] (2) p E a r g 1の取得 ：
    [0416] 形質転換株は大腸菌 K - 1 2株亜株 C H 7 5 4 〔メ チォニン， ト リ プト フ ア ンおよびアルギニン （ a r g H , アルギニノ サク シナー ゼの欠損変異） 要求性〕 を用いて行った。 C H 7 5 4のコ ンビテン ト ' セルはダジヱル ト らの方法 〔Dagert, M. et al ： Gene 6_ 23 ( 1 9 7 9 ) ] で調製した。 即ち、 L培地 5 0 mUc: C H 7 5 4株を 植菌し、 東京光電比色計で 6 6 0 n mにおける吸光度 （ 0 D ) が 0.5になるまで 3 7でで培養した。 培養液を氷水中で 1 0芬間冷却 してか 遠心した。 冷却した 0. 1 M塩化カルシウム.2 0 ml'に菌体を 再懸濁し、 0 に 2 0分間置いた。 菌体を再遠心し、 0. 1 M塩化力 ルシゥム 0. 5 mlに懸蜀し、 0 で 1 8時間置いた。 塩化力ルシゥ厶 処理した菌液 1 5 0 ^に前記リガーゼ反応混合物 5 0 を添加 混合し、 0 でに 1 0分間置いてから 3 7 でで 5分間加温した。 次い で L培地 2 rolを添加し、 3 7 °Cで 2時間振盪培養した。 生理食塩水 で 2回遠心洗浄後、 各 4 0 〃 g /mlのメ チォニンおよびト リプト フ ア ンならびに 2 5 〃 g / ml相当のカナマイ シンを添加した A寒天培 地に塗布し、 3 7 でで 3 日培養した。 出現した形質転換株の培養菌 体から、 前記の p L C 2 0 - 1 0を単離したのと同一の方法により プラス ミ ド D N Aを単離した。 このプラス ミ ド D N Aは制限酵素消 化とァガロースゲル電気泳動で解析した結果、 第 5図に示すように P L C 2 0 - 1 0のアルギニン生合 系遺伝子群を含む P s t I - B a m H I断片と p C E 5 3のカナマイ シン耐性遺伝子を含む P s t I - B a m H I断片とが結合した構造を有していた。 このプ ラス ミ ドを P E a r g 1と命名した。
    [0417] このプラス ミ ド D N Aを用いて CH 7 5 4を前記と同様に再形質 転換した結果、 アルギニン非要求性株が高頻度で得られ。 それらは 全てカナマイ シン耐性形質を獲得していた。 またアルギニン生合成 経路上、 ァセチルォルニチンデァセチラーゼ （ a r g E ) を欠損し た大腸菌 K - 1 2株亜株 C S R 6 0 3を形質転換した場合もカナマ ィ シン耐铨獲得株は全てアルギニン穽要求性を示した。
    [0418] またこのプラス ミ ド D N Aを用いてコ リネバクテリ ゥム · グルタ ミ クム L A 2 9 1 (アルギニン要求性） を形質転換した。 コ リネバ クテリ ウム · グルタ ミ クム L A 2 9 1はコ リネパクテリ ゥム · グル タ ミ クム A T C C 3 1 8 3 3由来のリゾチーム感受性変異姝 L一 15 铢から通常用いられる変異処理により誘導されたアルギニン要求性 の変異株であり、 アルギニン生合成経路上アルギニンの 2段階前の 前駆体であるシ ドルリ ン—でも生育応答しないことから、 その欠損変 異はアルギニノ コハク酸シンテターゼ （大腸菌の a r g G遺伝子産 物に対応） あるいはアルギニノ サク シナーゼ （大腸菌の a r g H遺 伝子産物に对応） の部位にあると推察されるものである。 コ リネバ クテリ ゥム * グルタ ミ クム L A 2 9 1株の種培養を N B培地に植菌 し、 3 0でで振盪培養した。 O D 0.6になった時点で集菌し、 該 細胞を R C G P培地に 1 rag /mlのリゾチームを含む液 （ p H 7.6 ) に約 1 03 細胞/ mlとなるように懸濁し、 L型試験管に移して 3 0 でで 5時間緩やかに振盪反応してプロ トプラス ト化した。 このプロ トプラス ト菌液 0.5 mlを小試験管にとり、 2.5 0 0 x gで 5分間遠 心分離し、 T S M C緩衝液 1 mlに懸篛して遠心洗浄後、 T S M C緩 衝液 0.1 mlに再懸蜀した。 この菌液に 2倍濃度の T S M C緩衝液と p E a r g lプラス ミ ド A溶液との 1対 1混合液 1 0 0 " ^を 加えて混和し、 次いで T S C緩衝液中に 2 0 % P E G 6.0 0 0を 含む液 1.0 ralを添加して混合した。 3分後 2, 5 0 0 x gで 5分間遠
    [0419] O PI 心分離にかけて上澄み液を除去し、 沈降したプロ トプラス トを 1 ml の R C G P培地 （ p H 7. 4 ) に懸濁してから 3 0 °Cで 2時間緩やか に振盪した。 ついでこのプロ トプラス ト懸濁液の 0. 3 mlをカナマイ シン 4 0 0 g / [111を舍む1¾ C G P寒天培地 （ R C G P培地に 1. 6 %寒天を含む培地、 PH7. 4 ) に塗布し、 3 0 "tで 6 日間培養した。 出現したカナマイ シン耐性形質転換株は全てアルギニン非要求性 を示した。
    [0420] またこの形質転換株の培養菌体から前記の P C E 5 3を単離した のと同一の方法によりプラス ミ ド D N Aを単離し、 制限酵素消化と ァガロースゲル電気泳動で解析した結果、 各種制限酵素切断様式で 特徵付けられる p E a r g 1 と同一の構造を有するものであること がわかった。
    [0421] (3) p E a r g 1保有秣による L -ア^ギニンの生産 ：
    [0422] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2、 コ リネ バタテ リ ゥム · ノ、ーキユ リ ス A T C C 1 3 8 6 8、 およびブレビバ クテ リ ゥム · フラブ厶 A T C C 1 4 0 6 7のプロ トプラス トを形質 転換して p E a r 1を導入した。 コ リネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2、 コ リ ネバクテ リ ウム * ノ、ーキユ リ ス A T C C 1 3 8 6 8、 およびブレビバクテ リ ウム ， フラブム A T C C 1 4 0 6 7をそれぞれ N B培地にて 3 0 で 1 6時間振盪培養し、 その種培養 0. 1 mlを 1 0 «11の 3 3 M培地の入った L字型試験管に接 種し、 モノ一型培養槽にて 3 0 でで振盪培養した。 ◦ Dが 0. 1 5 に なった時点で 0. 5単位/ mlになるようにぺニシリ ン Gを添加した。 さらに培養を続け、 0 D約 0. 6になったところで細胞を集菌し、 R C G P培地に 1 mg/mlのリゾチームを舍む液 （ p H 7. 6 ) 2 mlに 懸濁し、 L字型試験管に移して 3 0 で 1 4時間緩やかに振盪して プロ トプラス ト化した。 このプロ トプラス ト菌液 1 mlを小試験管に とり 2, 5 0 0 x gで 1 5分間遠心分離し、 沈澱物を T S M C緩衝液
    [0423] O PI ？ 1 mlに懸濁して遠心 （ 2.5 0 0 x g ) 洗浄後、 T S M C緩衝液の 0.1 nilを加えて再懸濁した。 これに 2倍濃度の T S M C緩衝液と上記で 単離した p E a r g 1 D 液の 1対 1混合液 1 0 0 ^を加えて混 和し、 実施例 1 と同様に P E G 6, 0 0 0を介した形質転換を行い、 形質発現させた後、 0.3 mlをカナマイ シン 4 0 0 g / mlを含む R C-G P寒天培地に塗布し、 3 0 でで 1 0 日間培養した。
    [0424] 出現したカナマイ シン耐性形質転換株を 4 0 0 mlS S M培地で振 盪培養し、 0 Dが 0.15になったところで 0.5単位/ mlとなるように ぺニシリ ン Gを添加し、 さらに◦ Dが 0.6 5まで培養し、 集菌した 菌体から実施例 3の p C Ε 5 3の単離法と同様な方法でプラス ミ ド を単離した。 これらのプラス ミ ドを制限酵素消化し、 ァガロースゲ ル電気泳動で解析した結果、 各種制限酵素切断様式で特徵付けられ る P E a r g 1'と同一の構造を有するものがあることがわかった。 この.ような形貧転換株がコ リネバクテリ ウ厶 · グルタ ミ クム K 4 6 ( F E R B P - 3 5 6 ) ， コ リネバクテリ ゥム -ハーキユ リ K 4 7 ( F E R M B P - 3 6 7 ) ， およびブレビバクテリ ウ厶 · フラブム K 4 8 ( F E R M B P — 3 5 7 ) である。
    [0425] コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム A T C C 1 3 0 3 2 ， コ リネ ノ クテ リ ゥム · ハーキュ リ ス A T C C 1 3 8 6 8 , ブレビバクテ リ ゥ ム · フラブム A T C C 1 4 0 6 7およびそれらの p E a r g 1保 有株の L -アルギニン生産試験を行った。 N B培地中で 3 0で， 16 時間振盪培養した種培養 0.5 mlを生産培地 〔廃糖蜜 8 0 g (ダルコ —ス換算） ， （ N H 4)2 S 04 g , K H 2 Ρ 04 0.5 g ， Κ 2 Η Ρ 04 0.5 g , C a C 03 2 0 gを水 1 に含み、 p H 7.0に調整した培地〕 の入った試験管に接種し、 3 0 で 7 2時間 振盪培養した。 培養後、 培養濾液をペーパーク口マ トグラフィ一に かけ、 ニンヒ ド リ ン発色後比色定量して L -アルギニン生成量を測 レアこ o
    [0426] OMPI 結果'を第 9表に示しす。
    [0427] ブ Π Π Π Π
    [0428] レリリリリ
    [0429] ネネネネビ L — アルギニン
    [0430] ノノノノノ
    [0431] 、 ( mg / m l ) 、、、， ， 株
    [0432] ククククク
    [0433] テテテテテ 0
    [0434] Α A Aκ κリ Π πリリν7
    [0435] ゥゥゥゥ Tゥ T T 44 1. 6
    [0436] .ム厶ムム厶 C C C 76
    [0437] C C C · · · · .
    [0438] 0
    [0439] ハノググフ 111 ,
    [0440] ルル 1一ラ 43 CO.
    [0441] キキタブタ，00 o o 1. 8
    [0442] ム ή ήo δ C 3、ヽヽ <.
    [0443] クク 872リリ 0
    [0444] ススム厶 ブレビバクテ リ ゥム フラブ厶 1. 0
    [0445] K 4 8.
    [0446] OMPI
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. ァミ ノ酸の生合成に係わる酵素の遺伝子を含む D N A断片とべク タ — D N Aと-の組換え体 D N Aを保有せしめたコ リネバクテ リ ゥム 属またはブレビバクテ リ ゥム属に属する微生物を培地中に培養し、 培養物中にァミ ノ酸を生成蓄積せしめ、 該培養物からアミノ酸を採 取することを特徵とするアミ ノ酸の製造法。
    2. アミ ノ酸がヒスチジン， ト リ プ ト フ ァ ン， フ ヱニルァラニン， イ ソ ロ イ シン， チロ シンまたはアルギニンである特許請求の範囲第
    1項記載の製造法。
    3. 該遺伝子を含む D N A断片が原核生物， 真核生物， バクテリオフ ァ ージ， ウ ィ ルスまたはプラスミ ドに由来することを特徵とする特 許請求の範囲第 2項記載の製造法。 ,
    4. 該原核生物がェッ シエ リ ヒア属， コ リ ネバクテ リ ゥム属'， ブレビ ノ クテリ ウ厶属， ミ クロバクテ リ ウム属， パチルス属， スタフィズ コッカス属， ス ト レプトコッカス属またはセラチァ属に属する細菌 由来の遺伝子であることを特徵とする特許請求の範囲第 3項記載の 製造法。
    5. 該細菌が、 ヒスチジンアナログ， ト リ プ ト フ ァ ンアナログ， フ エ 二ルァラ ニンまたはフ ヱニルァラ ニンアナ口グに耐性である特許請 求の範囲第 4項記載の製造法。
    6. 該細菌が、 1， 2， 4 — ト ァゾール— 3 —ァラニン， 4 —メ チル ト リプトフ ァ ン， 5 — メ チルト リプトフ ァ ン， 6 — メ チルト リプト ファ ンまたはパラフルオ ロ フ ヱ二ルァラ二ンに耐性である特許請求 の範囲第 5項記載の製造法。
    7. 該 D N A断片がアンス ラニル酸合成酵素遺伝子を含む特許請求の 範囲第 1項記載の製造法。
    8. 該 D N A断片が微生物にト リブト フ ア ンアナ口グ耐性を与えるこ
    OMPI WIPO とを特徵とする特許請求の範囲第 7項記載の製造法。
    9. 該ト リブ ト フ ァ ンアナログが 4 —メ チル ト ひプ ト フ ア ン ， 5 -メ チル ト リプトフア ンおよび 6 -メ チルト リプト フア ンから選ばれる ことを特徵とする特許請求の範囲第 8項記載の製造法。
    10. 該ア ンスラニル酸合成酵素の.ト リプトフアンならびに ト リプトフ ア ンアナ口グ阻害が解除されている特許請求の範囲第 7項記載の製 造法。
    11. 該 D N A断片が 3 -デォキシ— 2 —ケ ト — D—ァラピノ —ヘプッ 口ソ ン酸 7 -ホスフヱー ト合成酵素、 コ リス ミ ン酸ミ ユターゼ、 プ レフヱ ン酸デヒ ドラターゼ， プレフヱネー トデヒ ドロゲナーゼまた はプレチ口シンアミ ノ ト ラ ンスフェ ラーゼの遺伝子を含む特許請求 の範囲第 1項記載の製造法。
    12. 該 D N A断片が微生物にフヱニルァラニン， チロ シンまたはそれ らのアナ口グに耐性を与えることを特徵とする特許請求の範囲第 1
    1項記載の製造法。 '
    13. 該 D N A断片がァスパラギン酸からス レオニンに到るス レオニン 生合成に係る酵素の遺伝子を含む特許請求の範囲第 1項記載の製造 法。
    14. 該 D N A断片が微生物にヒスチジンまたはヒスチジンのアナログ に耐性を与える D N A断片であることを特徴とする特許請求の範囲 第 1項記載の製造法。
    15. 該ぺクタ -が、 コ リネバクテ リ ゥム属またはブレビバクテ リ ム属 属する微生物に由来するべクタ -ならびにその誘導体であること を特徴とする特許請求の範囲第 1項記載の製造法。
    16. 該ぺクタ -が p C G l , p C G 2 , p C G 4 , p C G l l , p C E 5 1 ， p C E 5 2 , p C E 5 3 , p C E 5 4および p C B l O lか ら選ばれることを特徵とする特許請求の範囲第 1 6項記載の製造法。
    17. 該微生物がコ リネバクテリ ゥム属またはブレビバクテ リ ゥム属に
    OMPI
    U 属する特許請求の範囲第 1項記載の製造法。
    18. 該微生物がァミ ノ酸生産性を有することを特許とする特許請求の 範囲第 1 7項記載の製造法。
    19. 該微生物がコ リネバクテリ ウム · グルタ ミ クム， コ リネバクテリ ゥム · ノ、 —キュ — リ ス， ブレビバタテ リ ゥム · フラブムおよびブレ ビバクテ リ ゥム · ラク トファ -メ ンタ厶からえらばれる特許請求の 範囲第 1 7項記載の製造法。
    20. エッ シェ リ ヒァ属， コ リネバクテリ ゥム属またはブレビバタテリ ゥム属に属する微生物由来のァミ ノ酸生合成に闋与する遺伝子を舍 む D N A断片とべクタ — D N Aとの組換え体を舍むコ リネバクテリ ゥム属またはブレビバクテリ ゥム属に属する微生物。
    21. 了ミ ノ酸がヒスチジンである許請求の範囲第 2 0項記載の微生物。
    22. コ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K 3 2 , A T C C 3 9 2 8 1 , コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K 4 9 F E R M B P— 464 ， コ リネバクテ リ ウム * ノ、—キユ リス K 3 3 ， A T C C 3 9 2 8 2 , ブレビバクテ リ ゥム · フラブ厶 3 4 , A T A C C 3 9 2 8 3 , ま たはブレビバクテ リ ウム · ラタ ト フア ーメ ンタム Κ 3 5 ， A T C C
    3 9 2 8 4である特許請求の範囲第 2 1項記載の微生物。
    23. ァミ ノ酸がト リプトファ ンである特許請求の範囲第 2 0項記載の 微生物。
    24. コ リ ネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム K 2 0 ， A T C C 3 9 0 3 5 , コ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ クム Κ 3 1 ， A T C C 3 9 2 8 0ま たはコ リネバクテ リ ゥム · グルタ ミ ク厶 K 3 7 ， A T C C 3 9 2 8 5 である特許請求の範囲第 2 3項記載の微生物。
    25. ァ ミ ノ酸がフエ二ルァラ二ンである特許請求の範囲第 2 0項記載 の微生物。
    26. コ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム K 3 9 ， F E R M P - 7088 である特許請求の範囲第 2 5項記載の微生物。
    27. 了 ミ ノ酸がィ ソロイ シンである特許請求の範囲第 2 0項記載の微 生物。
    28. コ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム K 4 1 ， F E R M P - 7161 またはブレビバクテ リ ウム * フラブム K 4 2 ， F E R M B P —
    3 5 5である特許請求の範囲第 2 7項記載の微生物。
    29. 了ミ ノ酸がチ口 シンである特許請求の範囲第 2 0項記載の微生物。
    30. コ リ ネバクテ リ ウ厶 · グルタ ミ クム K 4 4 ， F E R M P — 7163 またはコ リ ネバクテ リ ウム · グルタ ミ クム K 4 5 ， F E R M P - 7 1 6 4である特許請求の範囲第 2 9項記載の微生物。
    31. アミ ノ酸がアルギニンである特許請求の範囲第 2 0項記載の微生 物。
    32. コ リ ネパ:クテ リ ウ厶 · グルタ ミ クム K 4 6 ， F E R M B P - 356 またはブレビバクテ リ ウ厶 · フラブ厶 K 4 8 ， F E R M B P - 357 である特許請汆の範囲第 3 i項記載の微生物。
    O PI
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    优先权:
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